Claves de Biología Molecular

Mutaciones

• Variabilidad: Capacidad de los organismos de reproducirse de forma diferente a ellos hasta cierto punto.

Modificaciones (Reflejan la capacidad de adaptación):

• Son masivas
• Son reversibles
• Son respuesta a nuevas condiciones de vida
• No se heredan

Mutaciones (Cambios cualitativos y cuantitativos):

• Son repentinas e individuales
• No son reversibles
• Se transmiten a las generaciones siguientes

Clasificación de las Mutaciones

Según el origen:

• Naturales o espontáneas: ocurren normalmente.
  • Artificiales, o Inducidas por agentes físicos y/o químicos, provocadas por la mano del hombre.

Según su efecto sobre la capacidad de adaptación y fertilidad del organismo (selección natural):

• Positivas
• Neutrales
• Negativas (Letales/Deletéreas)

Según su dirección:

• Directa: Del gen A → a
• Inversa: Del mut. a → A

Según el tipo celular:

• Somáticas: Afectan al individuo pero no son hereditarias.
  • Germinales: Se presentan en las células sexuales.

• Mutaciones Basadas en su efecto
  • Morfológicas: Se detectan a simple vista.
  • Bioquímicas: Se detectan usando pruebas.
  • De regulación: De genes.
  • De comportamiento
  • Condicionales: Su expresión depende del ambiente.
• Según la naturaleza de los cambios de estructuras

1. Micromutaciones o mutaciones puntuales
   1. Transición: Cambio de una pu x pu ó pi x pi (sustitución de bases).
   2. Transversión: Cambio de una purina por una pirimidina (sustit. de bases).
   3. Adición o inserción de uno o más nucleótido(s)
   4. Deleción o pérdida de 1 ó + nucleótidos.

Sustitución de bases

Anemia falciforme o “Sickle cell” anemia

• Forma falciforme de los glóbulos rojos
  • Ác. Glutámico es sustituido por Valina debido a una sustitución de bases.

• Sustitución de bases:
  • Cuando se es heterocigoto (Ss) para la condición se puede sobrevivir, hay codominancia (ambos alelos se expresan)
  • Cuando se es homocigoto recesivo (ss) es más difícil pero con tratamientos (transfusiones de sangre) se puede sobrevivir más tiempo.
  • Daño al corazón, hígado, anemia severa

• Macromutaciones (en células sexuales) o Aberraciones Cromosómicas.

1. Euploidías: Incrementos o disminuciones por genomios completos: n (monoploidía/haploidía), 2n (diploidía), 3n (triploidía), 4n, 5n, etc. (- a partir de 3 genomios a más: poliploidía; – alopoliploidía, genomios de organismos diferentes)
2. Aneuploidías

   Incremento o disminución en número menor a un genomio.

   • Monosomía (Fórmula: 2n – 1)

     Cuando pierde un cromosoma completo.

   • Nulisomía (Fórmula: 2n – 2)

     Cuando pierde un par de cromosomas completos.

   • Trisomía (Fórmula: 2n + 1)

     Cuando tiene un cromosoma de más

   • Tetrasomía (Fórmula: 2n + 2)

     Cuando el organismo tiene dos cromosomas homólogos de más.

   • Doble trisómico (Fórmula: 2n + 1 + 1)

     Cuando el organismo tiene dos cromosomas no homólogos de más.

3. Cambio en estructura de un cromosoma por pérdida, duplicación o cambio estructural de uno o varios genes: Deleción, Duplicación, Inversión, Translocación, Isocromosoma, anillo, etc.
   • Deleción, (d) pérdida de un segmento cromosómico que puede ser terminal o intercalar. Ej. Síndrome de Cry-du-chat (-5p)
   • Inversión (inv), cuando un bloque de genes de un cromosoma rota 180º. Puede ser:

• I. Pericéntrica, cuando compromete al centrómero

I. Paracéntrica, aquella inversión que no compromete al centrómero.

Duplicaciones, (d) se originan por repeticiones de (trinucleótidos hasta) genes completos. Ej. Distrofia de Duchenne.

Isocromosoma, (i) se originan por duplicación en la fase S, seguida de deleción doble y suelde en los extremos con deleción.

• Anillo, (r) forma un cromosoma cuando pierde sus extremos teloméricos y sufre suelde en los extremos quebrados.
• Traslaciones, ocurren con tres roturas en el mismo cromosoma, con migración de un segmento y su reinserción en la 3a. rotura. (ins)
• Traslocaciones (t), se refiere al intercambio de segmentos cromosómicos y puede ser:

1. Recíproca, si el intercambio ocurre luego de una rotura y suelde de segmentos intercambiados entre dos cromosomas que pueden ser homólogos o no.
2. Robertsoniana, que a su vez puede ser:
   1. Cuando las quiebras ocurren en el brazo corto de un cromosoma y en el brazo largo del otro cromosoma.
   2. Si la quiebra ocurre en el brazo corto de ambos cromosomas y luego se sueldan los restos quedando un cromosoma con dos centrómeros, uno de los cuales se inactiva.

• Inserción (ins), cuando un segmento de cromosoma migra y se inserta en la rotura de otro cromosoma; igual que las traslaciones se representa con “ins”

• Agentes mutágenos.

Son capaces de inducir mutaciones

1. Agentes físicos, originan aberraciones cromosómicas, mayormente deletéreas. Clases:
   1. Radiaciones electromagnéticas:
      • Radiaciones ionizantes, Ejm.

        Rayos X (> mut. Letales)

        Rayos gamma (Co⁶⁰, Cs¹³⁷)

        similares a los rayos X

      • Radiaciones no ionizantes

        Los rayos ultravioleta, se usan para polen, bacterias, esporas y otros microorganismos.

   2. Radiaciones Corpusculares, son haces

      de partículas atómicas, viajan a velocidades menores de la luz. Ej. Neutrones y protones.

2. Agentes químicos
   • Son más efectivos que los físicos. Tienen mejor nivel de especificidad para ataque y corte.
   • Originan principalmente mutaciones génicas.
   • Clasificación según su mecanismo de acción:
     1. Sustancias alquilantes, capaces de ceder grupos alquilos (CH3, C2 H5, NH, etc) al

N, O ó S del ADN. ARN o proteínas (logrando apurinar nucleótidos o esterificar –

grupos fosfato del gen). Ejm. EMS

• Inhibidores de bases nitrogenadas como la cafeína, la teobromina y el etil uretano, que facilitan el cambio de enlaces simples a dobles

y consiguiente tautomerización de las bases nitrogenadas, y enlaces incorrectos de éstas.

• Oxidantes, desoxidantes y radicales libres.

  Ácido nitroso, aldehídos, peróxidos, sales de metales pesados, oxígeno y otros. Causan daños como la desaminación y replicación incorrecta del ADN

• Antimetabolitos, principalmente análogos de bases que modifican el proceso normal de replicación del DNA. Ej. La 2-aminopurina, el 5- bromouracilo, la 5-desoxiuridina

  G = C → G = BU → A=BU → A = T

• Colorantes de propiedades alcalinas como

Las acridinas y proflavinas que forman complejo con ADN y ARN respectivamente, originando variaciones en la lectura del código genético.

• Tasa de mutación

Frecuencia relativa con que se produce una mutación en un locus dado en una población; dada por lo general como el número de sucesos por gen y generación.

.Tasa de reversión

Frecuencia relativa con la que una mutación determinada retorna al estado silvestre, dada en porcentaje con relación a la tasa de mutación.

• KNOCKOUT GÉNICO

  Reemplazo de un gen en un organismo vivo.

  Organismo knockout, el que sufrió un reemplazo de esta naturaleza.

  TRANSGEN

  Gen insertado a un organismo al que no se le

alteró sus propias copias normales.

• TRANSPOSONES

  O elementos genéticos transponibles, grupo de

Unidades genéticas que pueden moverse, o

“transponerse”, por el genoma.

• CROMOSOMOPATÍAS COMUNES:

  – SÍNDROME DOWN : 47, XX, + 21

  – “ PATAU : 47, XY, + 13

  – “ CRY-DU-CHAT : 46, XX, – 5 p

  – “ EDWARDS : 47, XY, + 18

  – “ TURNER : 45, X0

  – “ KLINEFELTER : 47, XXY

• OTRAS:

  – SINDROME DE X – FRAGIL : 46, XX, ( r ) X

Secuenciación del ADN

El primer ácido nucleico secuenciado fue el t-RNA de alanina que tiene 76 nucleótidos. Las enzimas utilizadas fueron la ribonucleasa T1 y fosfodiesterasas del bazo (remueve terminal 5’) y del veneno de serpiente ( ” 3’ terminal). Los fragmentos resultantes fueron identificados por electroforesis o por cromatografía.

• El descubrimiento de la ER y el desarrollo de la técnica de clonación molecular del DNA, han permitido mejorar y avanzar las técnicas de secuenciamiento del DNA.

La estrategia para secuenciar ácidos nucleicos en general comprende

a) El fraccionamiento de los polinucleótidos en fragmentos lo suficientemente pequeños para ser totalmente secuenciados; b) secuenciación de los fragmentos;

c) repetir a) y b) pero produciendo cortes alternativos que rebasen los puntos de escisión de la primera colección;

d) Ordenamiento de los fragmentos super poniendo los fragmentos obtenidos en ambos fraccionamientos.

• La estrategia de secuenciamiento antes señalada la comparten los métodos químico y enzimático. Las ventajas del segundo han superado largamente al método químico y mejorado por el uso de fluorocromos distintos para cada tipo de nucleótido, luego automatizado ha permitido el secuenciamiento de los genomas de muchos organismos.

• Los fragmentos generados se separan por electroforesis en geles de acrilamida que permiten diferenciar tamaños de fragmentos escindidos en una sola base.

Las bandas que muestra el gel corresponden a moléculas de longitud decreciente y forman una escalera que permite ordenar los nucleótidos de forma consecutiva.

• El Método Enzimático o de Sanger:

  Utiliza DNA desnaturalizado, la hebra que se desea secuenciar sirve como molde.

  Un cebador, complementario y específico para la secuencia estudiada, marcado radioactivamente.

  Los cuatro deoxinucleósidos trifosfatos. Y se divide en cuatro alícuotas, a cada una de las cuales se añade un dideoxinucleósido trifosfato conocido.

  Fragmento Klenow de la polimerasa I o la secuenasa.

  La síntesis se lleva a cabo en dos pasos:

1º El cebador se alarga usando los 4 deoxinucleósidos trifosfato, incluido el dATP marcado con P32

2º Se produce la terminación de cadena por el dideoxinucleósido trifosfato añadido en pequeña cantidad.

• El resultado en cada tubo es una colección de fragmentos de tantos tamaños como veces presente esté la base estudiada.
• El análisis por electroforesis en gel de acrilamida nos dará la secuencia complementaria del gen o segmento de DNA en estudio.

USO DE FLUOROCROMOS:

• Su uso elimina la radioactividad y permite automatizar la última parte del proceso.
• El uso de un solo fluorocromo Tetrametil rodamina para marcar los cebadores y luego “leer” el gel corrido con un rayo laser
• Usar cuatro fluorocromos, uno para cada base: NBD (4-cloro-7nitrobenceno-2-oxaldiazol), tetrametilrodamina, fluoresceína y rojo de Texas, por su diferente longitud de onda, son registrados directamente en la computadora.

Aplicaciones de la secuenciación de ADN:

Detección de mutaciones

Método de diagnóstico rutinario (relación entre enfermedad y mutación puntual)

Secuenciación de ADNs fósiles

Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias (la mayoría están dañadas o degradadas)

Diagnóstico de enfermedades genéticas

Diagnóstico prenatal / Diagnóstico preimplantación de enfermedades hereditarias o determinación del sexo del feto previamente a su implantación en procesos de fecundación in vitro

Identificación de especies y control de cruces entre animales

Para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie más barata a los precios de otra más cara, o el comercio ilegal de especies en peligro

Secuenciación de genomas

Conocimiento básico y aplicado de diferentes organismos (incluido el genoma humano)

• Aplicaciones de la secuenciación de ADN
  • • Detección de mutaciones

Método de diagnóstico rutinario (relación entre enfermedad y mutación puntual)

• Secuenciación de ADNs fósiles

Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias (la mayoría

están dañadas o degradadas)

• Diagnóstico de enfermedades genéticas

Diagnóstico prenatal / Diagnóstico preimplantación de enfermedades hereditarias o determinación del sexo del feto previamente a su implantación en procesos de

fecundación in vitro

• Identificación de especies y control de cruces entre animales

Para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie más

barata a los precios de otra más cara, o el comercio ilegal de especies en peligro

• Secuenciación de genomas

Conocimiento básico y aplicado de diferentes organismos (incluido el genoma humano)

SECUENCIACION POR HIBRIDACION

• Varios grupos de investigadores entre 1991 y 1993 comienzan a construir verdaderos chips de ADN sobre vidrio modificado o propileno.
• Para reconstruir una secuencia desconocida es necesario construir un chip con todas las posibles combinaciones de nucleótidos conocidos, con los que pueda hibridarse específicamente.
• También se puede fijar al soporte la secuencia desconocida e hibridar sucesivamente el chip con oligonucleótidos de secuencias conocidas, radioactivas o fluorescentes.
• Útil para identificar mensajeros, polimorfismos, mutaciones hasta del tipo de sustitución de una base.