Factores Clave en el Diseño de Scaffolds para Ingeniería de Tejidos

Propiedades Mecánicas: La rigidez del scaffold influye en la expresión génica. Un hidrogel blando indica baja densidad de entrecruzamiento, mientras que un hidrogel duro implica alta densidad, afectando el fenotipo celular y la transmisión de señales.

Presentación de Factores de Crecimiento: Es crucial la correcta presentación de factores de crecimiento solubles. Estos pueden ser fijados en la superficie del scaffold o injertados.

Degradación: La degradación del biomaterial modifica sus propiedades mecánicas, lo que puede modular el destino celular. Es necesario sincronizar la degradación con la secreción de la matriz para evitar influencias no deseadas en la expresión génica.

Adhesión Celular: El scaffold debe simular la matriz extracelular (ECM), asegurando la interacción celular mediante integrinas u otras proteínas de membrana como CD44.

Topografía: La topografía del scaffold modula la forma celular, el fenotipo y la secreción de nueva ECM.

Mecanotransducción: Las tensiones mecánicas se traducen en respuestas químicas a través de integrinas, citoesqueleto de actina y cascadas de señalización. El modelo de tensegridad explica cómo las fuerzas externas se transmiten a través del citoesqueleto, causando cambios en la función celular.

Estrategias para Mejorar el Crecimiento y la Vascularización

• Modificación de Scaffolds:
  • Tamaño de poros y gargantas de conexión grandes (200-400 micras) y altamente interconectados.
  • Modificación superficial con heparina u otras biomoléculas para favorecer el anclaje de factores de crecimiento angiogénicos.
  • Scaffolds con microcanales que imiten la arquitectura vascular fisiológica.
• Incorporación de Factores de Crecimiento:
  • Inmovilización covalente en la superficie del scaffold o embebidos en un recubrimiento de colágeno.
  • Recubrimiento de poros con geles que contengan factores de crecimiento, microesferas o nanopartículas que los liberen, o geles de PRP.
  • Factores empleados para promover la invasión endotelial, brote vascular y maduración capilar.
• Incorporación de Células Vasculares Proangiogénicas:
  • Células endoteliales (HUVECs, células microvasculares dérmicas).
  • Periocitos autólogos.

Células Diferenciadas

Ventajas:

• Carecen de rechazo inmunológico si son autólogas.
• Función diferenciada para la regeneración del tejido diana.

Desventajas:

• Cantidad limitada de células disponibles.
• Mortalidad en el lugar de extracción.
• Capacidad limitada de división.
• Células dañadas en pacientes con enfermedad.
• Desdiferenciación en cultivo in vitro.

Biorreactores: Herramientas para el Cultivo de Tejidos

Los biorreactores son sistemas de cultivo dinámico que mimetizan las condiciones fisiológicas para mantener y promover el crecimiento celular para la regeneración de tejidos.

Funciones Clave:

• Control de calidad y estandarización para la fabricación GMP.
• Control de parámetros fisicoquímicos durante el cultivo.
• Estandarización, automatización y escalado de la regeneración.
• Proporcionar un ambiente 3D para la función celular.
• Proporcionar señales regulatorias de la función celular.
• Aumentar la transferencia de masa en los composites células/scaffolds.
• Siembra uniforme de células en el scaffold.
• Reducir costes.

Componentes:

• Cámara de cultivo.
• Reservorio.
• Sistema de intercambio de gases y medio de cultivo.
• Instrumentación.

Requisitos Técnicos:

• Biocompatibilidad y esterilización fácil.
• Cámara adaptada al scaffold.
• Tubos y membranas de silicona permeables a gases.
• Regulación de T, pH y O2.
• Estimulación física o eléctrica del scaffold.

Tipos de Biorreactores:

Biorreactor de Pared Rotatoria:

El scaffold flota en un cilindro con paredes rotatorias, manteniendo el scaffold suspendido por el balance entre la fuerza gravitacional y la fuerza de arrastre hidrodinámica.

Biorreactor de Compresión o Tracción:

El biorreactor de compresión se utiliza en la regeneración del cartílago articular mediante la aplicación de carga mecánica. La compresión puede ser dinámica o estática, provocando el flujo de fluido a través del scaffold. Los biorreactores de tracción se utilizan para estimular scaffolds en la regeneración de tejidos como tendones, ligamentos, hueso o tejido cardiovascular.

Células Madre: Tipos y Características

Células Madre Embrionarias (ES)

• Descendientes de la masa celular interna de la blástula.
• Número no limitado de divisiones simétricas.
• Genoma diploide completo.
• Pluripotencialidad.
• Capacidad de integrarse en todos los tejidos fetales.
• Capacidad de formar células germinales.
• Clonogénicas.
• Expresión del factor de transcripción Oct-4.
• Predominantemente en fase S del ciclo celular.
• No inactivación del cromosoma X.

Acondicionamiento en Cultivo:

• Cultivo en fibroblastos murinos embrionarios irradiados.
• Cultivo en medio seroso y proteínas morfogenéticas.
• Selección de colonias con morfología indiferenciada.
• Cultivo con suero o sustituto + bFGF.
• Prueba de pluripotencialidad: formación de teratoma.

Desventajas/Riesgos:

• Posibilidad de crecimiento de tumores (teratomas).
• Rechazo inmunológico de células alogénicas.
• Aspectos éticos.

Células Madre Adultas (Stem Cells)

• Células no diferenciadas entre células diferenciadas en los tejidos.
• Capacidad de auto-renovación.
• Capacidad de generar múltiples tipos de células diferenciadas.
• Funciones: mantenimiento y reparación del tejido, regulación de otros fenotipos.
• Sobreviven en un ambiente específico (nicho celular).

Ventajas sobre Embrionarias:

• No conllevan cuestiones éticas o legales.
• Carencia de moléculas extrañas de MHC, no hay rechazo inmunológico.
• No hay riesgo de formación de teratoma.

Desventajas:

• Potencial proliferativo menor.
• Desarrollo de linaje restringido.
• No hay consenso sobre su caracterización.
• Poblaciones heterogéneas.
• Difíciles de encontrar en el tejido.
• Morbilidad del sitio donante.

Extracción:

• Cresta ilíaca o esternón.
• Aspiración de tejido medular.
• Los primeros mL contienen mezcla de células hematopoyéticas, adipocitos, progenitores endoteliales y osteoprogenitores.

Células Madre Adultas Mesenquimales

Se producen a partir de células comprometidas en diferentes estadios de diferenciación.

Extracción:

Se extraen a través de la médula ósea mediante centrifugación. Se seleccionan las células mononucleares, que incluyen monocitos y células mesenquimales. Solo las mesenquimales se adhieren al recipiente de cultivo.

Biorreactor de Perfusión

Permite una siembra uniforme y renovación continua del medio de cultivo. El medio se hace pasar a través de los poros del scaffold mediante una bomba. El flujo debe equilibrar la transferencia de nutrientes, la eliminación de desechos y la retención de la matriz extracelular.

Se utilizan circuitos separados para la siembra y el cultivo a largo plazo.

Tensiomiografía

Variable más Influyente:

La distancia interelectródica (IDE) es la variable que más influye en la medida de la tensiomiografía, ya que la separación entre los electrodos afecta la contracción muscular inducida y su medición.

Aplicaciones:

1. Comprobar la efectividad de terapias o cirugías en la recuperación muscular.
2. Análisis del avance de enfermedades neuromusculares.
3. Seguimiento de cambios agudos en la respuesta muscular (potenciación, rigidez, fatiga, recuperación).

Electrooculograma (EOG)

Fundamento:

El EOG mide las variaciones de voltaje córneo-retiniano, aprovechando que la esfera ocular es un dipolo eléctrico con la córnea electropositiva y la retina electronegativa. Los electrodos se colocan cerca de los cantos temporal y nasal de los ojos.

Preprocesado:

• Amplificación con amplificador de instrumentación.
• Filtro paso banda para eliminar ruidos musculares.
• Amplificación en varias etapas para mayor ancho de banda.
• Filtro Notch para eliminar interferencia de red (50Hz).
• Comparador para dar forma a la señal.
• Procesamiento de la señal.

Interferencias y Soluciones:

• Interferencia de red: Filtro paso bajo 30-50Hz, Filtro Notch.
• Oscilación de la línea base: Polinomio de interpolación.
• Movimientos del ojo: Procesamiento de la señal.
• Otros biomarcadores: Procesamiento de la señal.

Electroencefalograma (EEG)

Parámetros para Distinguir Estados de Conciencia (Despierto vs. Sueño Ligero):

La frecuencia y la amplitud de la señal EEG tienen una relación inversa. En el sueño, las neuronas trabajan de forma más sincronizada, lo que resulta en una señal de menor frecuencia y mayor amplitud. Se puede calcular el valor eficaz en cada ventana y obtener un cociente para comparar ambos estados.

Parámetros para Distinguir Estados de EEG (Normal, Interictal, Epilepsia):

La señal EEG pasa de ser débil y desordenada en un estado normal a tener gran amplitud y un patrón ordenado en la epilepsia. Se puede calcular la amplitud de la señal en el dominio temporal y obtener una medida de la frecuencia en un estudio de la densidad espectral de potencia.

Propuestas:

1. Cálculo de los valores eficaces de la señal de EEG (µV).
2. Cálculo del valor de frecuencia (Hz) en el que se encuentra el valor máximo de la densidad espectral de potencias del EEG.

Algoritmo para Calcular el Parámetro de Contenido Espectral:

1. Filtrado de las señales con un filtro paso banda entre 1Hz y 30 Hz.
2. Obtención de la densidad espectral de potencia mediante la transformada directa de Fourier.
3. Cálculo de energías en bandas bajas (theta y delta) y bandas altas (alfa y beta).
4. Cálculo del cociente de energías: Isueño=Einf/Esup.

Valores Umbrales:

Si Isueño > 1, hay más energía en las bandas inferiores (sueño). Si Isueño < 1, hay más energía en las bandas superiores (despierto). Cuanto más se aleje el indicador por arriba de 1, más profundo es el sueño.