PCR: Técnica de Amplificación de ADN, Aplicaciones y Tipos

PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa

La PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) es una técnica in vitro de amplificación de ADN que permite obtener millones de copias idénticas de un fragmento específico. Se han desarrollado diferentes variantes:

PCR múltiple: Amplifica varios fragmentos distintos.
RT-PCR: Amplifica fragmentos de ARN.
PCR a tiempo real: Cuantifica la cantidad de ácidos nucleicos.

Ventajas de las Técnicas de PCR

Como técnica de amplificación: Ahorran tiempo y están automatizadas.
Como técnica de detección: Requieren menor cantidad de muestra y permiten cuantificar secuencias concretas.

Aplicaciones de la PCR

Diagnóstico y pronóstico de enfermedades genéticas e infecciosas.
Evaluación y respuesta a tratamientos.
Estudios de expresión génica.
Mutagénesis (para conocer la función de un gen).
Genotipado.
Medicina forense.

Esta técnica fue ideada por Kary Mullis en 1983. La PCR es un proceso enzimático catalizado por la ADN polimerasa, basado en la replicación del ADN.

Para lograr esto, hay que solucionar dos problemas:

¿Cómo conseguir que en cada ciclo de la técnica únicamente se copie el fragmento que nos interesa, dentro de una mezcla compleja de moléculas de ADN?
- Solución: Diseño de cebadores específicos que permiten la amplificación exclusiva de un fragmento concreto de ADN.
¿Cómo conseguir que no se produzca la inactivación de la ADN polimerasa por la temperatura elevada, necesaria en la fase de desnaturalización del ADN molde?
- Solución: Descubrimiento de las ADN polimerasas termoestables.

Componentes Clave de la PCR

Cebadores (Primers)

Son oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es complementaria a las regiones que flanquean el fragmento de ADN a amplificar. Se diseñan por parejas:

Cebador F (forward): Se une a la hebra molde en dirección 3′-5′.
Cebador R (reverse): Se une a la hebra molde en dirección 5′-3′.

Definen y limitan la región diana de una molécula de ADN que se amplificará.

ADN Polimerasas Termoestables

Para que la ADN polimerasa pueda sintetizar nuevas cadenas de ADN, es necesario que el ADN molde sea monocatenario. Son enzimas aisladas de arqueobacterias termófilas con actividad polimerasa a altas temperaturas. Estas enzimas catalizan la incorporación de nucleótidos en dirección 5′-3′ a partir de una pequeña región de doble hélice, usando como molde ADN monocatenario e iones de Mg⁺².

Características de las ADN Polimerasas Termoestables

Realizan la actividad polimerasa a 70-75ºC.
Capacidad de mantener la actividad polimerasa a >95ºC.

Tipos de ADN Polimerasa Termoestables

Se clasifican según sus capacidades enzimáticas secundarias:

Con actividad exonucleasa 5′-3′ pero sin actividad exonucleasa 3′-5′: No son capaces de corregir errores.
Con actividad exonucleasa 5′-3′ y actividad exonucleasa 3′-5′: Poseen actividad correctora; detectan cuándo se incorpora un nucleótido erróneo.
Con actividad transcriptasa inversa: Capacidad para usar ARN como molde.

Ciclo Básico de una PCR

Cada ciclo consta de tres fases:

Fase 1: Desnaturalización: Debe ser larga y con alta temperatura (94-95ºC, 15-30 min) para asegurar una desnaturalización completa.
Fase 2: Hibridación (Alineamiento): Se realiza a una temperatura de 50-65ºC. El valor depende de la Tm (temperatura de melting) de los cebadores. El tiempo oscila entre 30-60 minutos.
- Temperaturas de hibridación más elevadas que la Tm de los cebadores: Implican mayor rigurosidad y, en consecuencia, mayor especificidad.
- Temperaturas de hibridación más bajas que la Tm de los cebadores: Implican mayor rendimiento, pero mayor hibridación inespecífica de los cebadores.
Fase 3: Extensión (Elongación): Se realiza a la temperatura óptima de polimerización de la enzima usada. En el caso de la Taq polimerasa, es de 72ºC. El tiempo de extensión depende de la velocidad de polimerización de la enzima.

Preparación de la Mezcla de Reacción

Se calcula la cantidad necesaria de cada reactivo multiplicando por el número de muestras a procesar, más un extra para cubrir posibles errores y controles (positivos y negativos). Se reparte la cantidad en cada tubo de reacción y se añade el ADN molde.

Controles Positivos: Tubo con mezcla máster + ADN molde que contiene el fragmento a amplificar.
Controles Negativos: Tubo con la mezcla máster en el que se sustituye el ADN molde por agua.

Termociclador

Aparato en el que se lleva a cabo la PCR. Permite programar ciclos repetitivos con diferentes temperaturas y tiempos. Incluye las siguientes etapas:

Desnaturalización inicial: Inicia la reacción de la PCR. Consiste en calentar la mezcla a 94-95ºC durante varios minutos.
Ciclos de replicación: El número de ciclos oscila entre 25 y 35. Más de 40 ciclos aumentan la probabilidad de productos no deseadas. Se programa la temperatura y el tiempo de incubación, así como el número de repeticiones del ciclo (número de replicaciones), que depende del número inicial de copias del fragmento que se quiere amplificar.
Extensión final: Consiste en una incubación única a la temperatura óptima de polimerización de la ADN polimerasa durante 5-10 minutos. Asegura que todos los productos de PCR estén completos y en doble hélice.
Mantenimiento: La programación del termociclador finaliza a 4ºC sin límite de tiempo.

PCR Estándar: Análisis de Productos Amplificados

Se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa + marcador de tamaños.

La presencia de una única banda indica que la PCR funcionó correctamente.
La presencia de varias bandas de diferentes tamaños indica la presencia de productos no deseados. Se debe repetir la reacción variando los parámetros del termociclador y la mezcla.

Interpretación de Resultados

Resultado Positivo (+): La observación de la banda específica es suficiente para afirmar que la secuencia diana está presente. Para descartar un falso positivo, se realiza un control negativo (mezcla + agua). Si se detecta alguna banda en el control negativo, indica contaminación de algún reactivo o pipeta.
Resultado Negativo (-): La muestra no contiene la secuencia diana. Puede deberse a un fallo en los reactivos o a la presencia de inhibidores de la PCR. El control positivo de la técnica, procesado simultáneamente con las muestras, sirve para validar las mezclas. Si los reactivos funcionan bien, se observará la banda. Si el reactivo falló, no habrá banda. Para descartar la presencia de inhibidores, se realiza una nueva PCR amplificando un gen control. Si el control amplifica bien, se confirma que la muestra es negativa para la secuencia diana. Si no amplifica bien, la muestra no es apta para PCR.

PCR a Tiempo Real

El proceso de amplificación se monitoriza ciclo a ciclo mediante productos fluorescentes. Se realiza en un termociclador a tiempo real que incorpora un lector de fluorescencia, el cual mide la intensidad en cada tubo en cualquier momento de la PCR.

Ventajas de la PCR a Tiempo Real

Mayor rapidez en la detección cuantitativa de secuencias diana.
Resultados más fidedignos.
Minimiza los problemas de contaminación.
Permite la cuantificación de los amplicones producidos y del ADN diana inicial presente en la muestra.

Cinética de Amplificación

Una vez que se consigue asociar la fluorescencia con la producción de amplicones, se puede estudiar la cinética de amplificación de la PCR mediante curvas de amplificación. Estas curvas se obtienen al representar la emisión de fluorescencia en cada ciclo de PCR respecto al número de ciclo. Tienen tres zonas:

Zona o fase de ruido: La única fluorescencia es debida a la señal de fluorescencia de fondo de cada tubo. Corresponde a los primeros ciclos de PCR, en los que el nivel de replicones está por debajo del nivel de detección del aparato. La amplitud depende de la cantidad de secuencia diana: a menor número de secuencias diana, más ciclos se necesitan para la detección.
Zona o fase de crecimiento exponencial: Abarca 4-6 ciclos y es la auténtica fase exponencial de producción de amplicones.
Zona o fase de meseta: El rendimiento disminuye en los últimos ciclos.

Sistemas Fluorescentes de Detección de Amplicones

Independientes de la secuencia: Se basan en el uso de agentes fluorescentes intercalantes en el ADN. El aumento de replicones incrementa la fluorescencia, pero disminuye la especificidad.
Específicos de secuencia: Se basan en el uso de sondas marcadas que hibridan en la región central.

Tipos de Sondas

De hidrólisis: Oligonucleótido sintético con un fluorocromo donante (reporter) en el extremo 5′ y un quencher en el extremo 3′. (Ej: TaqMan)
Balizas moleculares (Molecular Beacons): Oligonucleótidos específicos para PCR a tiempo real.
FRET (Transferencia de Energía de Resonancia de Fluorescencia): Hibridan en la zona central del amplicón.

Aplicaciones de la PCR a Tiempo Real

Cuantificación absoluta: Expresa la cantidad de la secuencia de la muestra en unidades de concentración o número de copias por unidad de volumen.
Cuantificación relativa: Expresa la concentración de la secuencia diana en relación con la concentración de un gen de referencia (con un número de copias constante).

Curva de Fusión (Melting Curve)

Es la gráfica que se obtiene representando la fluorescencia frente a la temperatura. Se realiza una vez concluida la PCR. Al principio, la fluorescencia es máxima y va disminuyendo hasta llegar al punto de fusión del amplicón, donde aparece un punto de inflexión en la curva. Para visualizar mejor el punto de fusión, el termociclador calcula la curva de picos de fusión. Si al finalizar la PCR se sintetizaron productos no deseados, en la curva de fusión aparecerán puntos de inflexión adicionales, y en la curva de picos de fusión aparecerán varios picos.

Tipos de Curva de Picos de Fusión

Curva con un único pico de fusión a la temperatura correspondiente al punto de fusión de la sonda: Indica que el ADN molde no presenta mutaciones.
Curva con un único pico de fusión a una temperatura inferior al punto de fusión de la sonda: Indica la presencia de una mutación en homocigotos.
Curva con dos puntos de fusión, uno a la temperatura del punto de fusión de la sonda y otro a una temperatura inferior: Indica una mutación en heterocigotos.