Investigación de Glucosa

Reacción de Benedict Cualitativa

Se basa en la reducción del cobre en solución alcalina y calor.

• Colocar 3 ml de reactivo de Benedict Cualitativo en un tubo de ensayo.
• Añadir 0.3 ml de orina.
• Hervir por 3 minutos en baño María hirviente.
• Enfriar por reposo durante 5 minutos.

Resultado positivo: Precipitado rojo ladrillo al fondo del tubo.

Resultado negativo: Permanece azul o con un color verdoso sin precipitado.

Sustancias que dan resultado positivo: Glucosa, lactosa, levulosa, pentosas.

Test para Ácidos Biliares

Los ácidos biliares reducen la tensión superficial de los líquidos que los contienen.

• Colocar 3 ml de orina en un tubo de 18 x 150 ml.
• Espolvorear sobre la superficie una pequeña cantidad de azufre pulverizado finamente (flor de azufre).

Si el azufre cae al fondo enseguida, la orina tiene ácidos biliares en cantidad mayor de 0.01% o más.

Sustancias que dan resultados falsos positivos: Cloroformo, alcohol, trementina, timol.

Investigación de Cuerpos Cetónicos

• En un tubo de ensayo, colocar 3 ml de orina y añadir 3 gotas de ácido acético. Mezclar.
• Añadir 1 ml de agua oxigenada.
• Luego, añadir unos 500 mg de nitroprusiato en polvo y agitar suavemente para disolver.
• Colocar en la zona superior 1 ml de hidróxido de amonio.

Resultado positivo: Anillo verde en la interfase (positivo a cuerpos cetónicos).

Práctica de Fisiología Digestiva: Rol Fisiológico de la Ptialina (Digestión del Almidón)

Fundamento Fisiológico

El alimento en la boca se mezcla con la saliva, lo cual se favorece por la masticación. Esta última fragmenta las partículas grandes de alimentos y las mezcla con las secreciones de las glándulas salivales. En las glándulas salivales, los gránulos secretorios (cimógeno) que contienen las enzimas salivales se descargan en los conductos a partir de las células acinosas. Diariamente se secretan 1500 ml de saliva, con un pH ligeramente menor de 7.0, pero que se aproxima a 8.0 durante la secreción activa. La saliva contiene dos enzimas digestivas: la lipasa lingual, secretada por la glándula de la lengua, y la alfa amilasa salival (ptialina), secretada por las glándulas salivales. La saliva también contiene mucinas, que son glucoproteínas lubricantes del alimento y protectoras de la mucosa oral. Además, contiene IgA, inmunoglobulina que representa la primera defensa inmunitaria contra bacterias y virus.

La alfa amilasa salival ataca al almidón. Sin embargo, el pH óptimo para esta enzima es de 6.7, y su acción es inhibida por el jugo gástrico ácido en el momento del ingreso del alimento al estómago. El activador de la amilasa salival es el cloro. Siendo su sustrato el almidón, hidroliza los enlaces alfa 1-4 para producir dextrinas, alfa-limitantes, maltotriosas y maltosa. Esta función hidrolítica es la acción catalítica que estudiaremos en la presente práctica. El almidón, polímero de la glucosa, da color azul con la solución de yodo. El almidón está constituido por un 15%-20% de amilosa y un 80%-85% de amilopectinas.

Procedimiento

Luego se determinarán los sustratos remanentes y los productos de degradación intermedia del almidón en cada digerido (1, 2, 3 y 4), por separado, empleando soluciones de Lugol y Benedict cualitativo.

Conclusiones

• Influencia del pH salival y gástrico en la digestión del almidón.
• Influencia del cloro sobre la actividad de la amilasa salival.
• Verificar la ubicación de los puntos de hidrólisis del almidón por acción de la alfa amilasa salival.

Práctica de Grupos Sanguíneos y Factor Rh

Introducción

• En 1900, Landsteiner descubrió que el suero de algunas personas aglutinaba los glóbulos rojos de otras y que este fenómeno podría ser usado para clasificar a las personas en diferentes fenotipos de grupos sanguíneos. Se reconocen 4 fenotipos comunes: O, A, B y AB. También se han identificado antígenos de los subgrupos del tipo A y B.
• Cada tipo de glóbulo rojo transporta un antígeno determinado, específico, que le es característico. El plasma de las personas tiene aglutininas naturales o anticuerpos diferentes al de su propio grupo. Por ejemplo, las personas del Grupo A tienen aglutininas Anti B. El plasma de las personas del Grupo B tiene aglutininas (anticuerpos naturales) Anti A. El plasma de las personas del Grupo O tiene un título bajo de aglutininas Anti A y Anti B. (Es muy importante saber que algunas personas del Grupo O pueden tener un título elevado de aglutininas Anti A y Anti B y ser donantes peligrosos).
• Es absolutamente necesario y obligatorio hacer siempre una prueba de compatibilidad mayor y menor entre el donante y el receptor antes de realizar una transfusión de sangre, cualquiera que sea el tipo de sangre y/o Rh.
• El fenotipo ABO de una persona es determinado mediante reacciones de aglutinación de los hematíes con antisueros monoclonales Anti A, Anti B, Anti AB y antisueros de los subgrupos correspondientes.

Determinación del Grupo Sanguíneo

• Este procedimiento se basa en la aglutinación de los glóbulos rojos (que transportan un antígeno específico) que se produce cuando están en presencia de su correspondiente anticuerpo específico.
• Los reactivos usados para la tipificación de los grupos del Sistema ABO contienen anticuerpos monoclonales IgM. Estos reactivos producirán aglutinación directa de los glóbulos rojos que transporten el antígeno específico correspondiente. La determinación del grupo sanguíneo puede hacerse por el método del tubo de ensayo o por el método en lámina portaobjeto.

Método en Lámina Portaobjeto

Materiales y Reactivos

• Suero monoclonal Anti A
• Suero monoclonal Anti B
• Suero monoclonal Anti AB
• Lámina excavada o lámina portaobjetos

Procedimiento para Determinar el Grupo Sanguíneo

4.- Colocar una gota de sangre al lado de cada una de las gotas del antisuero correspondiente sin tocar los reactivos, para evitar contaminación cruzada, y luego mezclar bien usando aplicadores.

5.- La lectura deberá hacerse antes de que se seque la mezcla. El tiempo máximo habitual es de tres minutos.

Interpretación de las Pruebas con Eritrocitos en la Determinación del Grupo Sanguíneo

+: Indica aglutinación macroscópica.

-: Indica que no hay aglutinación.

Factor Rho (D)

• Aparte de los antígenos del sistema ABO, existe otro que es el sistema de antígenos del Rh, que son de gran importancia fisiológica y clínica.
• El Factor Rh (aglutinógeno o antígeno), llamado así porque fue estudiado por primera vez en los monos del género Rhesus, es en realidad un sistema compuesto por muchos antígenos. Ver Tabla:

Fisher-Race        Wiener

Dce                        Rho

DCe                       Rh1

DcE                        Rh2

Dce                        rh (hr’)

dCe                        rh’

dcE                         rh”

dCE                        Rhy

DCE                        Rhz

• El factor D es, con mucho, el más antigénico, y el término “Rh Positivo”, como generalmente se usa, significa que el individuo tiene aglutinógeno D.
• El individuo Rh Negativo no tiene antígeno D y solo forma la aglutinina Anti D cuando se le inyectan células D positivas. El suero que se emplea rutinariamente para tipificar el Rh es un suero Anti D.
• El 85% de los caucásicos son Rh Positivos y el 15% restante Rh Negativos. Las personas Rh negativas (D Negativas) que reciben una transfusión de sangre Rh Positiva (aún muchos años antes) forman anticuerpos Anti Rh, tienen títulos Anti D apreciables y dan reacciones transfusionales graves cuando reciben una transfusión de sangre Rh (D) Positiva.
• Igualmente sucede cuando una madre Rh (D) Negativa concibe un hijo D positivo, porque pequeñas cantidades de sangre del feto se filtran a la circulación materna en el momento del parto y desarrollan títulos elevados de aglutininas Anti Rh durante el post parto. Durante el embarazo siguiente, las aglutininas desarrolladas contra el antígeno RH cruzan la placenta y llegan al feto que ha heredado el antígeno Rh positivo del padre, produciéndose la reacción antígeno-anticuerpo que causa hemólisis y la Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido (Eritroblastosis Fetal).

Determinación del Factor Rh

Materiales y Reactivos

• Reactivo Antisuero Monoclonado Anti – Rho (Anti D)
• Lámina portaobjeto
• Varillas de vidrio o aplicadores
• Lancetas descartables
• Desinfectante y algodón
• Lápiz de cera marcador

Procedimiento

• En una lámina portaobjetos, colocar 2 gotas de la sangre problema.
• Al costado de las gotas de sangre, colocar una gota del reactivo Suero Anti Rh. Mezclar bien.
• Observar inmediatamente para ver si existe o no aglutinación.

Interpretación

Sangre total paciente +   RESULTADO

Suero Anti- Rh (D)

Aglutinación                                Rh (D) Positivo

No Aglutinación         Rh (D) Negativo

Investigación de la Sensibilización de los Hematíes

Cuando algún anticuerpo (por ej. Gammaglobulina – IgG) se fija y recubre al glóbulo rojo, se dice que el eritrocito está sensibilizado. Los eritrocitos pueden sensibilizarse in vivo, y esto ocurre, por ejemplo, en la Eritroblastosis Fetal (EF), que es una enfermedad del feto y del recién nacido. Se caracteriza por aglutinación y fagocitosis de los eritrocitos del feto, que se produce cuando una madre siendo Rh Negativa y el esposo Rh Positivo, concibe un niño Rh positivo.

El niño hereda el Rh Positivo del padre. Durante el embarazo, la madre desarrolla aglutininas Anti – Rh por la exposición al antígeno (aglutinógeno Rh) del niño. A su vez, estas aglutininas Anti Rh de la madre difunden por la placenta al feto y recubren los glóbulos rojos del feto. Los hematíes del niño están ahora sensibilizados y esto produce la aglutinación y lisis de los hematíes del propio hijo. Durante el primer embarazo puede no producirse daño, pero durante el segundo embarazo el 3% presentará EF; durante el tercer embarazo el 10% presentará EF, y así va aumentando la incidencia.

Se puede investigar la presencia de estos anticuerpos (IgG- anti Rh) que recubren a los hematíes del niño mediante el Test de Coombs Directo (test de Antiglobulina directo), que es el objeto de la presente práctica.

Test de Coombs Directo

Esta prueba se realiza en los hematíes del paciente.

Fundamento

Esta prueba se fundamenta en la aglutinación de los eritrocitos humanos sensibilizados por anticuerpos gamma-globulínicos que se produce cuando se les coloca en presencia de un suero antihumano gamma- globulínico preparado en conejos. Este suero antiglobulínico puede ser específico para globulina IgG, o también puede ser un preparado monoclonalmente obtenido.

Esta prueba demuestra directamente la sensibilización de los eritrocitos que se ha producido in vivo.

Materiales y Reactivos

• Centrífuga clínica y microscopio binocular
• Suero antiglobulínico de Coombs (Gamma IgG) (Monoclonal)
• Hematíes del paciente (Niño)
• Solución salina 0.85%
• Tubos de prueba de vidrio 13 x 100 mm y 12 x 75 mm
• Algodón, desinfectante de piel (alcohol yodado)
• Ligadura venosa, aguja y jeringas descartables
• Varillas de vidrio o mondadientes de plástico, pipetas Pasteur

Procedimiento

Lavado previo de los glóbulos rojos

1.- Medir aproximadamente 0.4 ml de sangre y colocar en el fondo de un tubo de prueba de 13 x 100 mm, añadir luego 6 ml de solución salina 0.85%. Mezclar suavemente por inversión.

2.- Centrifugar a 3400 rpm por 30 segundos hasta que las células se empaqueten al fondo del tubo.

3.- Decantar la solución salina completamente, limpiando la boca del tubo con papel servilleta.

4.- Repetir el lavado dos veces más, añadiendo una pequeña cantidad de solución salina al comienzo y mezclar para suspender bien los eritrocitos; y luego añadir una mayor cantidad de solución salina lavando hacia abajo la pared interna del tubo de prueba. Después del tercer lavado, el sobrenadante debe estar completamente limpio de sangre, absolutamente límpido y transparente.

5.- Ahora, calcular (aproximadamente) el volumen de los glóbulos rojos lavados, anotar este volumen, y añadir una cantidad de solución salina como para hacer una suspensión de glóbulos al 2%.

6.- En otro tubo de prueba, colocar 2 gotas de esta suspensión al 2% y añadir 1 gota de suero de Coombs.

7.- Centrifugar a 5000 rpm durante 15 segundos.

8.- Muy suavemente, con gran cuidado, percutir con un dedo el fondo del tubo, lo suficiente para dislocar el fondo celular y observar la aglutinación tanto macroscópica como microscópicamente con objetivo en seco a 40 X.

Resultado

• La presencia de aglutinación indica una Prueba de Coombs Directa Positiva, demostrando que los eritrocitos están sensibilizados.
• Ausencia de Aglutinación: Test de Coombs Directo: Negativo.

Interpretación

Esta Prueba Coombs Directa es Positiva en los casos de:

• Eritroblastosis Fetal
• Anemias Hemolíticas Autoinmunes
• Sirve también para el diagnóstico de reacciones transfusionales debido a incompatibilidad sanguínea.

Test de Coombs Indirecto

Detecta los anticuerpos presentes en el suero del paciente (madre) y para ello deben sensibilizarse primero in vitro algunos glóbulos rojos de otra persona de grupo conocido (Tipo O, por ejemplo) y luego de haber sensibilizado los glóbulos rojos escogidos se les aplica el Coombs Directo. Para sensibilizar a los glóbulos rojos seleccionados (conocidos) se debe primero incubar el suero del paciente (madre) con los eritrocitos seleccionados (grupo O, por ejemplo) para que las células se sensibilicen (es decir, se recubran con el anticuerpo sérico) si es que está presente, y, después averiguar si están sensibilizadas aplicándoles el test de Coombs Directo, tal como hemos descrito líneas arriba.

Test de Compatibilidad Cruzada

Examinar ambos tubos por aglutinación o hemólisis.

Luego, incubar ambos tubos A y B, en baño María a 37°C por 15 minutos.

Centrifugar por 1 minuto a 1000 RPM. Lectura del tubo B por aglutinación o hemólisis.

Luego, continuar con el tubo «A»: Tres lavados en solución salina 0.9%. Añadir suero de Coombs 2 gotas.

Centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto. Lectura por aglutinación o hemólisis.

Interpretación de Anticuerpos

Tubo «A»: detecta incompatibilidad hacia: Sistema ABO, MN, P, Lewis.

Tubo «B»: detecta incompatibilidad: Antic. Rh, Duffy, Kidd, Cellano y Antic. calientes.