1. Caracterización de los Procesos en Laboratorios de Citogenética y Biología Molecular

1.1 Materiales y Equipos

• Material fungible: De un solo uso.
• Material inventariable: Larga vida útil.

1.2 Instalaciones y Organización

• Laboratorios de cultivo celular:
  • Salas limpias (sin manipulación biológica).
  • Salas sucias (con manipulación).
  • Áreas de lavado y esterilización (uso de autoclave y estufas de esterilización).
  • Salas de observación con microscopios.
• Laboratorios de citogenética:
  • Áreas de procesado (preparación de muestras).
  • Bandeado (tinción de cromosomas).
  • Microscopía (digitalización de imágenes).

1.3 Personal y Funciones

• Administrativo: Gestión y organización de documentos.
• Técnicos: Análisis de muestras, tinción y mantenimiento del laboratorio.
• Facultativo: Supervisión de trabajos de investigación.
• Director: Gestión general del laboratorio.
• Responsable de calidad: Asegura el cumplimiento de estándares.

Recogida Celular

• Si las células están en suspensión, se extrae una porción del líquido después de la centrifugación.
• Si las células están adheridas, deben separarse antes de la recolección para evitar superposiciones en el microscopio.

2. Organización del Laboratorio de Biología Molecular

2.1 Materiales y Equipos

• Incluye cabinas de seguridad, termocicladores (PCR), espectrofotómetros, autoclaves, incubadoras, centrífugas y sistemas de electroforesis.

2.2 Instalaciones: Salas prePCR, PCR y posPCR

• PrePCR: Recepción, registro, preparación de reactivos y muestras (control de contaminación).
• PCR: Amplificación de ADN en termociclador.
• PosPCR: Análisis mediante electroforesis y documentación de geles, finalizando con la generación de informes.

2.3 Almacenamiento y Mantenimiento

• Temperatura ambiente (15-25°C): Muestras liofilizadas, tejidos en parafina.
• Refrigeración (4-8°C): Reactivos y muestras de corta duración.
• Congelación (-20°C): Ácidos nucleicos y plasma por corto tiempo.
• Ultracongelación (-80°C): Muestras biológicas a largo plazo.
• Criogenización (-180°C): Suspensión de actividad biológica para conservación indefinida.

3. Técnicas Básicas en Laboratorios de Citogenética y Biología Molecular

3.1 Cultivo Celular

• En suspensión: Células crecen en un medio líquido.
• En placa: Uso de medios sólidos (agar, placas de Petri).

3.2 Técnicas de Tinción

• Simples: Un solo colorante (azul de metileno).
• Diferenciales: Diferencia estructuras celulares (tinción de Gram, Wright, azul algodón de lactofenol).

3.3 Extracción y Análisis de Ácidos Nucleicos

• Extracción: Lisis celular (mecánica, química o enzimática).
• Purificación: Precipitación, centrifugación o separación por afinidad.
• Amplificación: PCR (polimerización del ADN).
• Electroforesis: Separación de fragmentos de ADN según tamaño.
• Secuenciación: Determinación del orden de bases en el ADN.
• Hibridación: Unión de secuencias de ADN complementarias.
• Clonación: Inserción de fragmentos de ADN en plásmidos para su replicación en bacterias.

4. Normas y Seguridad en el Laboratorio

4.1 Manipulación de Material Estéril y Técnica Aséptica

• Correcto almacenamiento y manipulación del material para evitar contaminación.
• Uso de EPI (Equipo de Protección Individual), diferenciación entre áreas limpias y sucias.

4.2 Gestión de Residuos Peligrosos

• Clasificación: Residuos no peligrosos y especiales.
• Eliminación: Incineración, reciclaje, almacenamiento seguro.
• Normas de seguridad: Uso de envases adecuados, evitar manipulación en solitario y minimizar riesgos.

4.3 Seguridad en el Laboratorio

• Protocolo personal: Lavado de manos, uso de EPI, conocimiento de los equipos.
• Protocolos de emergencia: Extintores, duchas de seguridad, lavaojos, ventilación.

Tipos de Cultivo Celular en Citogenética

En citogenética, se estudian los cromosomas y se realizan cultivos celulares para analizar enfermedades genéticas. Existen distintos tipos de células:

Tipos de Tejidos Celulares

• Tejido epitelial: Cubre el cuerpo y recubre cavidades internas.
• Tejido conjuntivo: Brinda soporte, protección y transporte de sustancias. Se divide en:
  • Laxo: Más matriz extracelular que células.
  • Denso: Predominan fibras (colágeno, elastina o reticulina).
  • Tejido adiposo: Puede ser blanco (grasa unilocular) o pardo (multilocular).
• Tejido muscular: Formado por miocitos, responsables del movimiento. Se clasifica en:
  • Liso: Contracción involuntaria y lenta.
  • Estriado esquelético: Contracción voluntaria, células multinucleadas.
  • Cardiaco: Contracción rápida e involuntaria, con uno o dos núcleos por célula.
• Tejido nervioso: Formado por neuronas y células gliales, encargadas de la protección y sostén.
• Sangre: Tejido líquido que transporta oxígeno, nutrientes y desechos.
  • Plasma: Contiene proteínas, gases y electrolitos.
  • Glóbulos rojos: Transportan oxígeno.
  • Glóbulos blancos: Defensa celular.
  • Plaquetas: Coagulación sanguínea.
• Células madre:
  • Embrionarias: Pluripotentes, pueden formar cualquier tejido.
  • Adultas: Generan células de su propio tejido.

Diagnóstico Citogenético Prenatal

Permite detectar anomalías cromosómicas en el embrión mediante cultivos celulares de tejidos embrionarios. Se recomienda en casos como:

• Enfermedades ligadas al cromosoma X.
• Antecedentes familiares con anomalías cromosómicas.
• Madres mayores de 35 años.

Pruebas Prenatales

• Amniocentesis: Se realiza entre la semana 15 y 20 para extraer líquido amniótico y analizar cromosomas. Puede diagnosticar síndrome de Down y otras alteraciones.
• Vellosidad corial: Extracción de tejido placentario entre las semanas 10 y 12. Tiene un mayor riesgo de aborto que la amniocentesis.
• Cordocentesis: Extracción de sangre fetal del cordón umbilical después de la semana 16. Es más riesgosa y se usa solo cuando no se pueden realizar otras pruebas.
• Otras pruebas: Determinación de madurez pulmonar fetal, análisis de polihidramnios y test de paternidad.

Diagnóstico Citogenético Postnatal

• Análisis de sangre periférica: Se extrae 1 ml de sangre al recién nacido para estudiar su cariotipo y detectar anomalías cromosómicas estructurales o numéricas.
• Diagnóstico de abortos de repetición:
  • Se analiza el cariotipo de restos abortivos.
  • Hasta el 60% de los abortos espontáneos están relacionados con anomalías cromosómicas como translocaciones o aneuploidías (trisomía, monosomía).

Cultivos Celulares en Investigación

• Animales de experimentación: Se usan para pruebas en modelos animales. El 60% de los estudios se hacen con ratones y el 20% con peces.
• Biobancos: Centros que almacenan muestras biológicas para investigación médica. En España, el Banco Nacional de Líneas Celulares (BNLC) coordina la red de biobancos.

Técnicas de Obtención, Mantenimiento y Propagación de Cultivos

Los cultivos celulares requieren medios artificiales que imitan las condiciones naturales.

Medios de Cultivo

• Componentes:
  • Nutrientes, factores de crecimiento y sistemas amortiguadores de pH.
  • Agar, extractos, peptonas, fluidos corporales como sangre o plasma.
  • Indicadores de pH, agentes reductores (para ambientes sin oxígeno) y agentes selectivos (favorecen ciertos microorganismos).
• Tipos de medios:
  • Generales: Permiten el crecimiento de múltiples microorganismos.
  • Selectivos: Favorecen el crecimiento de un solo tipo celular.
  • Diferenciales: Contienen indicadores para distinguir microorganismos según su metabolismo.
  • De enriquecimiento: Favorecen un microorganismo específico.

La mayoría de los medios comerciales vienen liofilizados y requieren rehidratación y esterilización.

Técnicas de Cultivo Celular

• Cultivo de órganos: Mantiene la estructura original del tejido.
• Cultivo celular primario: Se obtiene tejido o células disgregadas y se siembran en un medio adecuado.
  • Monocapa: Células adheridas a una superficie.
  • Suspensión: Células flotando en el medio.
• Histotípicos y organotípicos:
  • Histotípicos: Un solo tipo celular.
  • Organotípicos: Diferentes tipos celulares que imitan un órgano.
• Subcultivo: Se realiza para evitar el envejecimiento celular y asegurar su proliferación.
  • En células adheridas, se usa un tratamiento enzimático o mecánico para despegarlas.
  • Se pueden diluir en un nuevo medio o centrifugar antes de resembrarlas.

Métodos de Conservación Celular

• Largo plazo:
  • Congelación: A -140 ºC en nitrógeno líquido. Para descongelar, se usa baño maría a 37 ºC.
  • Liofilización: Se elimina el agua y se almacenan a -20 ºC.
• Corto plazo:
  • Subcultivo.
  • Suspensión en agua destilada: Se usa en hongos filamentosos y algunas bacterias, permitiendo su conservación por más de 5 años.

Técnicas de Sacrificio Celular

• Inhibidor mitótico: Detiene la reproducción celular y provoca su muerte.
• Fragmentación de la membrana celular: Uso de soluciones hipotónicas que causan un exceso de agua en la célula, provocando su ruptura por ósmosis.

Recogida Celular

• Si las células están en *suspensión*, se extrae una porción del líquido después de la centrifugación.
• Si las células están *adheridas*, deben separarse antes de la recolección para evitar superposiciones en el microscopio.

Protocolos de Asepsia y Prevención de Riesgos

• Mantener la manipulación de cultivos a menos de 25 cm de distancia.
• Trabajar en cabinas de flujo laminar.
• Uso de EPI (equipos de protección individual).
• Esterilización de utensilios mediante incineración.
• Control de temperatura y humedad para evitar contaminación.

Determinación del Número y Viabilidad Celular

Recuento Celular

• Cámara de Neubauer: Se usa para contar células manualmente.
• Contadores electrónicos: Miden concentración y tamaño celular automáticamente.

Viabilidad Celular

• Determina el porcentaje de células vivas en un cultivo.
• Métodos de tinción con colorantes o fluorescencia.
• Ensayos funcionales:
  • Cuantificación de ATP.
  • Biosensores de fluorescencia.
  • Microanálisis por energía de rayos X (cuantifica iones celulares).

Técnicas de Tinción

• In vivo: Se tiñen células vivas.

In vitro: Se fija y tiñe la muestra antes de su observación en el microscopio.