Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos: Protocolos y Técnicas

Lisis de Hematíes

1. Lisis de hematíes: Romper hematíes con tampón de lisis 1:3 (solución:lisis). Se pueden usar soluciones comerciales basadas en fenómenos osmóticos y/o detergentes suaves.
2. Centrifugado de la muestra: Obtención de sedimento (pellet) y sobrenadante.
3. Eliminación del sobrenadante: Eliminar la fracción líquida del sobrenadante con una pipeta Pasteur. Se eliminarán componentes del plasma y hemoglobina. Lavar los leucocitos con PBS.
4. Conservación del sedimento: Continuar con la extracción de ácidos nucleicos. En el sedimento quedan los leucocitos.

Obtención de Células Mononucleadas de Sangre Periférica (PBMC)

Detectar, aislar y estudiar ácidos nucleicos de retrovirus que infectan linfocitos, como VIH o HTLV.

Aislar células o PBMC (linfocitos y monocitos) antes de extraer los ácidos nucleicos. La centrifugación en gradiente de densidad requiere un medio de separación.

1. Colocar en un tubo el medio de separación encima de la sangre.
2. Centrifugar durante 20-30 minutos a 400-800 x g, según el reactivo utilizado.

Durante la centrifugación:

• El polisacárido del medio de separación causa la agregación de los hematíes, facilitando su rápida sedimentación.
• Los granulocitos, con una densidad mayor que el medio de separación, sedimentan en el fondo del tubo.
• Las células mononucleadas tienen una densidad menor que el medio de separación y se sitúan en la interfase entre este y el plasma.

3. Eliminar el plasma sobrenadante. Aspirar la capa de células mononucleadas con una pipeta Pasteur, transferirla a un tubo limpio y lavar con tampón (PBS) o solución salina para eliminar restos de plasma y plaquetas. PBS + ⥀ 1000 rpm.

El medio de separación es una mezcla de dos componentes:

• Ficoll: polisacárido sintético hidrofílico muy ramificado.
• Diatrizoato sódico.

El medio tiene una viscosidad baja, D 1,07 g/ml y una osmolalidad adecuada para la viabilidad celular. Ficoll-Paque es un polímero.

1. Extraer sangre en tubos con heparina o EDTA.
2. Transferir a un tubo Falcon de 50 ml con una pipeta Pasteur.
3. Añadir 1,5 µL de PBS calentado a 37ºC. Mezclar.
4. En un segundo tubo Falcon: añadir PBS a temperatura ambiente. La sangre se estratifica lentamente sobre el Ficoll, asegurando que las fases permanezcan separadas (inclinar el tubo con Ficoll y apoyar la pipeta en el lado interno del tubo para que la sangre resbale por la pared). Los glóbulos rojos y los granulocitos migrarán a través de la capa inferior.
5. Centrifugar a 400 rpm durante 20 minutos.
6. Eliminar el suero y el PBS.
7. Aspirar los linfocitos sin aspirar el Ficoll (tóxico) y colocarlos en un Falcon nuevo con PBS para lavar. Centrifugar.

Sacar el sobrenadante, dejar el pellet y disociar agitando. Lavar dos veces con PBS y centrifugar. Las células se resuspenden en medio de cultivo calentado.

En Vacutainer, solo centrifugar.

Cultivos Celulares

Métodos para la obtención de células *in vitro* mediante siembras controladas en medios adecuados.

Cultivos Monocapa

(En el propio frasco)

1. Retirar el medio de cultivo del frasco.
2. Lavar la monocapa con tampón o solución salina.
3. Iniciar *in situ*, en el frasco, el proceso de extracción.

Pasar la Monocapa a un Tubo

1. Despegar las células de la pared del frasco. Esto puede hacerse mecánicamente (raspador) o mediante métodos enzimáticos (tras retirar el medio de cultivo del frasco y lavar la monocapa con tampón, incubar las células en una solución de tripsina al 0,10-0,25%).

FFPE (Tejido Fijado en Formalina e Incluido en Parafina)

1. Con un microtomo, obtener cortes finos del bloque de parafina que contiene el tejido.
2. Transferir los cortes a un tubo Eppendorf.
3. Incubar secuencialmente con xilol y etanoles en concentraciones decrecientes (100%, 96%, 70%) y agua destilada.
4. El tejido desparafinado y rehidratado se somete a homogeneización química.

Extracción de Ácidos Nucleicos

Dos procesos principales: lisis celular para liberar los ácidos nucleicos e inactivación de las nucleasas celulares (ADNasas y ARNasas).

Solución de Lisis

• Detergentes: Componentes principales. Función: desestructurar la bicapa lipídica de las membranas y desnaturalizar las proteínas que se insertan en ella. Libera el contenido citoplásmico y nuclear al medio de reacción.
• EDTA: Quelante de cationes divalentes (calcio y magnesio). El magnesio es un cofactor de las ADNasas, necesario para su funcionamiento. Al atrapar los cationes de magnesio presentes en el medio de reacción, el EDTA inhibe la actividad de las ADNasas.
• Proteasas: Proteinasa K, digiere proteínas (incluyendo histonas) de la membrana celular y citoplasmáticas, y elimina nucleasas. Útil en muestras de tejidos frescos y FFPE: permite simultanear la digestión del tejido con la extracción de ácidos nucleicos.
• Agentes caotrópicos: Desnaturalizan macromoléculas impidiendo que realicen su actividad. El isotiocianato de guanidinio es un potente inactivador de ARNasas, utilizado para purificar ARN.
• SDS (Dodecil Sulfato Sódico): Compuesto tensioactivo aniónico, detergente, utilizado en muestras con EDTA.

• Lisozima o lisostafina: Para degradar la pared de bacterias grampositivas y gramnegativas.
• Liticase o zimolasa: Para células vegetales, levaduras y hongos.

Tratamiento CTAB

Para células con pared celular con alto contenido de polisacáridos y derivados polifenólicos que interfieren en los procesos enzimáticos en biología molecular. Se sustituye el SDS por otro detergente iónico, CTAB, que facilita la eliminación de estos compuestos en la purificación.

Eliminar ARN Presente en el Lisado

• Añadir ARNasa A al medio de reacción.
• Incubar a 37°C durante 30 minutos.

Sales Caotrópicas

Compuestos que influyen en la organización de las moléculas de agua y su interacción con macromoléculas (proteínas y ácidos nucleicos). Aumentan la solubilidad de sustancias apolares y modifican las interacciones intramoleculares no covalentes que mantienen la estructura secundaria y terciaria de las proteínas, desestabilizándolas.

Purificación con Solventes Orgánicos

I. Eliminación de Compuestos Solubles en Solventes Orgánicos

Para ADN genómico, se utiliza una combinación de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico en proporciones 25:24:1.

1. Mezclar volúmenes iguales del lisado y el reactivo, y agitar en vórtex. En esta mezcla:
   • Lisado: fase acuosa.
   • Cloroformo: disuelve lípidos y da fase orgánica a la mezcla.
   • Fenol: desnaturaliza y disuelve proteínas del lisado, integrándose en la fase orgánica.

2. Centrifugación. La mezcla separa dos fases: una acuosa (superior) con ácidos nucleicos, sales y componentes hidrosolubles del lisado, y una orgánica (inferior) con proteínas y lípidos.

II. Eliminación de Compuestos Solubles en Solventes Orgánicos

Transferir la fase acuosa a un tubo limpio y precipitar el ADN añadiendo acetato sódico e isopropanol o etanol al 100% frío.

(El ADN es una molécula polianiónica con carga fuertemente negativa debido a los grupos fosfato en el exterior de la doble hélice). En medio acuoso, esta carga neta negativa hace que las moléculas de ADN se repelan entre sí y se rodeen de una capa hidratante de moléculas de agua que las estabilizan. El ADN es soluble en agua, a pesar del gran tamaño de sus moléculas. Cuando se añade alcohol (agente deshidratante) al medio acuoso, se elimina la capa hidratante que rodea las moléculas de ADN.

III. Lavado del ADN

Eliminado el sobrenadante, el pellet de ADN se lava con etanol al 70-95% y se vuelve a centrifugar. El ADN es insoluble en etanol, permaneciendo en el sedimento, pero los restos de sales y contaminantes que hayan coprecipitado con el ADN son solubles en etanol, por lo que se eliminan con el sobrenadante.

IV. Resuspensión del ADN

El etanol interfiere en casi todas las técnicas de biología molecular, por lo que antes de resuspender el ADN hay que eliminarlo por completo. Los restos de las paredes del tubo se pueden eliminar invirtiendo el tubo sobre un material absorbente (papel de filtro), y el pellet de ADN se deja secar a temperatura ambiente con el tubo abierto (con el riesgo de contaminación).

Una vez seco, se resuspende en la cantidad adecuada de agua destilada o tampón de baja fuerza iónica a pH neutro o ligeramente alcalino, como el tampón Tris-EDTA (TE).

La rehidratación es un proceso lento. Se puede realizar una incubación inicial a 55-65°C seguido de incubación a temperatura ambiente con agitación suave hasta la completa disolución del pellet, o incubación en nevera a 4°C hasta el día siguiente.

Ventajas:

• Se obtiene ADN genómico de mayor peso molecular.
• Íntegro y muy puro.
• El ADN es de doble hélice.

Desventajas:

• Posibilidad de contaminación debido a la mucha manipulación y el uso de muchos tubos.
• Proceso muy largo.
• Reactivos tóxicos.

Precipitación con Sales (Salting Out)

Precipitación de proteínas en presencia de altas concentraciones salinas.

Se generan medios con elevada fuerza iónica. Esto determina un incremento en las interacciones hidrofóbicas entre las proteínas, disminuyendo su solubilidad en el medio acuoso y provocando su precipitación.

I. Precipitación de Proteínas

1. Añadir al lisado un volumen igual de una solución salina concentrada, que actúa como solución precipitante de proteínas, y agitar vigorosamente con vórtex durante 20-30 segundos.
2. Centrifugar la mezcla. Las proteínas sedimentan en el fondo del tubo como un pellet de color pardo, y en el sobrenadante quedan los ácidos nucleicos, sales y componentes hidrosolubles del lisado.

II. Precipitación del ADN

El sobrenadante se transfiere a un tubo limpio, se añade un volumen igual de isopropanol y se mezcla por inversión suave del tubo varias veces. El ADN precipita en forma de maraña de hebras blanquecinas, que se sedimentan mediante centrifugación.

III. Lavado y Resuspensión del ADN

Eliminar el sobrenadante y lavar el ADN con etanol al 70-95%, y resuspender en agua destilada o tampón TE como en el método anterior.

Ventajas: No se utilizan reactivos tóxicos.

Desventajas: Contaminación debido al uso de muchos tubos y proceso lento.

Cromatografía de Intercambio Iónico

Unión electrostática reversible de iones en solución a grupos funcionales cargados que están unidos covalentemente a una fase estacionaria.

Cuando los grupos funcionales de la fase estacionaria tienen carga neta positiva (+), se denominan intercambiadores aniónicos, porque van a unir reversiblemente los iones negativos (-) (aniones) de la solución. Cuando los grupos funcionales de la fase estacionaria tienen carga neta negativa (-), se denominan intercambiadores catiónicos, porque van a unir los iones positivos (+) (cationes) de la solución.

Para la purificación de ácidos nucleicos se usan matrices de sílice o celulosa (fase estacionaria) empaquetadas en columnas de polipropileno. A la matriz se le une covalentemente un intercambiador aniónico, porque los ácidos nucleicos son polianiones lineales con fuerte carga negativa (-) debido a los grupos fosfato. Los dos grupos funcionales positivos (+) más utilizados son metilaminoetanol (MAE) y dietilaminoetil (DEAE).

Las esferas de la columna están cargadas positivamente (+), y la columna es de resina para intercambio iónico.

1. La columna se carga con una dilución del lisado en tampón de baja salinidad y pH neutro. Los ácidos nucleicos tienen carga neta negativa (-) y se unen a los grupos funcionales del intercambiador, que tienen carga positiva (+). Las proteínas, los polisacáridos y los contaminantes del lisado con carga positiva (+) no se unen al intercambiador y eluyen de la columna.
2. La columna se lava con tampones de concentración salina creciente.

Ultrafiltración (Solo para PCR)

Retención por tamaño de las moléculas de ácidos nucleicos mediante membranas con un tamaño de poro determinado. Las membranas se sitúan en la base de columnas que ajustan en tubos colectores. Este método se utiliza para purificar productos de PCR con un tamaño superior a 150 pb.

1. La muestra (mezcla de reacción de PCR) se carga directamente en la columna y se centrifuga. Sobre el filtro quedan retenidos los productos amplificados de PCR, y al tubo colector pasan los contaminantes (primers, nucleótidos, sales, etc.).
2. El filtro se lava con etanol para eliminar restos de contaminantes.
3. Resuspensión: Añadir a la columna agua destilada o tampón TE, incubar unos minutos a temperatura ambiente y transferir a un tubo limpio por pipeteo.

Papel FTA

Contiene cuatro reactivos que protegen al ADN de nucleasas y bacterias. Se puede usar directamente para el análisis, y para ello se utilizan troqueladores o “punchers” manuales o automatizados para recortar la zona de la muestra.

1. Recortar uno o dos fragmentos de la tarjeta y añadirlos a un tubo con el papel.
2. Dejarlo toda la noche y centrifugar.
3. Del sobrenadante realizar la PCR.

Ventajas: Útil para el transporte y el almacenamiento de muestras.

Inconvenientes: Contaminación y no útil para determinados análisis como la hibridación de ARN.

Integridad del ADN y ARN

ADN genómico: En muestras en las que el ADN haya mantenido su integridad, se obtendrá una banda única de ADN perfectamente definida en la parte superior del gel. Si el ADN se fragmenta o degrada, aparecerá una estela fluorescente o *smear* a lo largo de la calle de electroforesis, cuya extensión e intensidad dependerán del grado de degradación.

Este patrón no es aplicable a muestras purificadas a partir de tejido FFPE, porque la fijación e inclusión en parafina provoca la fragmentación del ADN. En este tipo de muestras, no tiene sentido valorar la integridad por electroforesis, ya que siempre se observará un *smear*.

ADN plasmídico: Idealmente, se observa una única banda en la electroforesis, correspondiente al plásmido con su estructura nativa. Muchas veces se observa una banda débil correspondiente al plásmido con estructura relajada y una tercera banda correspondiente a dímeros.

ARN: Normalmente se observa un ligero *smear*, debido al ARNm (conjunto de múltiples moléculas distintas con tamaños diferentes), con dos bandas nítidas correspondientes al ARNr 28S y 18S. A veces se observa una tercera banda más débil correspondiente al ARNr 5.5S y 5S y a los ARNt.

Condiciones para la Integridad de las Muestras

• Usar tubos Eppendorf o criotubos con cierre hermético y libres de nucleasas (ADNasas y ARNasas).
• Almacenamiento en frío:
  • Muestras de ADN: si se van a utilizar en 4-5 días, almacenar en nevera a 4°C. Para tiempos mayores, congelar a –20°C o a –80°C.
  • Muestras de ARN: siempre en congelación, a –20°C para tiempos cortos o a –80°C para tiempos largos.
• Congeladores para almacenamiento: deben tener sistemas de seguridad:
  • Sistema de alarma para avisar en caso de mal funcionamiento.
  • Sistema de seguridad de CO2: para conservar la temperatura en caso de avería hasta que se trasvasen las muestras a otro congelador.
  • Sistema de monitorización de temperatura para comprobar posibles oscilaciones de temperatura.

Pureza de los Ácidos Nucleicos

Máxima absorbancia a una longitud de onda de 260 nm.

Cociente A260/A280

Parámetro más utilizado. Los principales contaminantes de los ácidos nucleicos (proteínas y derivados fenólicos) tienen una máxima absorbancia a 280 nm. Esta medida debe estar comprendida entre 0,1 y 1,0.

Cociente A260/A230

A 230 nm se detecta la máxima absorbancia de contaminantes menores, como carbohidratos y sales.

Absorbancia a 320 nm

Mide la turbidez, es decir, la presencia de partículas en suspensión. Este valor se resta de las medidas a 260, 280 y 230 nm antes de calcular los cocientes.

Absorbancia a 260 nm

Una unidad de absorbancia equivale a:

• 50 ng/μl (o 50 μg/ml) de ADN de doble cadena (ds).
• 33 ng/μl (o 33 μg/ml) de ADN de cadena sencilla (ss).
• 40 ng/μl (o 40 μg/ml) de ARN.

Concentración de ácido nucleico = (A260 – A320) · factor de dilución · factor de conversión.