Técnicas de Purificación por Afinidad y Cromatografía Covalente

Cromatografía de Afinidad

Conceptos Clave:

• Contraligando: Biomolécula retenida selectivamente.
• Ligando: Molécula que confiere selectividad a la fase sólida.
• El proceso es reversible.

Etapas de la Cromatografía de Afinidad

1. Elección del ligando.
2. Inmovilización del ligando.
3. Establecimiento de interacciones entre ligando y contraligando.
4. Elución de la materia no absorbida.
5. Elución del contraligando.

Consideraciones Importantes:

• La unión debe ser estable y tener un tamaño adecuado para una relación de afinidad óptima.
• Debe ser reversible y fácil de eluir.
• Se busca que al menos el 95% del contraligando se una a la matriz (PL/P ≥ 95%).
• El uso de un brazo espaciador contrarresta el impedimento estérico, pero debe evitar interacciones inespecíficas.

Evaluación del Absorbente Sintetizado

Se evalúa la densidad del ligando por unidad de peso de la matriz.

• Análisis por diferencia: Cantidad de ligando añadida inicialmente menos la cantidad de ligando recogida en el sobrenadante.
• Espectroscopia directa: Si el ligando absorbe por encima de 250 nm y la matriz tiene un índice de refracción similar al medio.

Matriz Soluble

Se utilizan medios constituidos por HCl 0.1 M, NaOH 0.1 M, NaOH 4 1%, ácido acético 50% para la liberación del ligando mediante hidrólisis del enlace ligando-matriz.

• Hidrólisis química o enzimática.
• Análisis elemental.
• Métodos radiactivos (método sensible).
• Valoración de grupos ionizables (valoración ácido-base normal, métodos colorimétricos).

Características de Absorción

• Capacidad estática: Miligramos de contraligando que pueden absorberse por gramo de ligando inmovilizado.
• Capacidad dinámica: Capacidad real de un ligando. Se eluyen primero los componentes no absorbidos.

Factores que Condicionan la Absorción y Elución

• Concentración de ligando: A mayor concentración de ligando inmovilizado, más fuerte es la unión.
• Dimensiones de la columna: Un incremento en la longitud de la columna aumenta la cantidad de ligando.
• Velocidad de flujo: Un incremento en el flujo disminuye la capacidad dinámica.
• pH: La cantidad unida depende del pH, siguiendo una curva de valoración ácido-base.
• Temperatura: Un incremento en la temperatura disminuye la afinidad.
• Fuerza iónica: Controla la magnitud de las interacciones electrostáticas, hidrofóbicas, polares y puentes de hidrógeno.

Métodos de Desorción

• Competición entre ligandos.
• Cambios en la fuerza iónica.
• Cambios en disolventes.
• Cambios de temperatura.
• Cambios en el tampón o pH.
• Agentes caotrópicos (SDS, urea).
• Electroforesis.

Cromatografía de Afinidad con Colorantes

Los colorantes son inhibidores competitivos. En la primera etapa, pueden retener entre el 5% y el 60% de la proteína. En un sistema de flujo, se recomienda una relación altura/diámetro de la columna entre 2 y 5.

Cromatografía de Metal Quelato (IMAC)

Separación basada en la diferencia de afinidad por iones de metales unidos a la matriz (LEC, MCAC, MCIC, IMAC). La unión de las proteínas se basa en la formación de enlaces de coordinación con aminoácidos como His, Cys, Trp, Tyr, Lys.

La complexación de los iones Zinc (Zn²⁺) y Cobre (Cu²⁺) con los grupos imidazol y tioles depende del pH. La máxima absorción ocurre a pH neutro, y la absorción es más débil a pH básicos. Otros iones metálicos como Ni, Co, Cd, Mg y Ca también forman enlaces de coordinación con His y Cys.

Cromatografía Covalente

Formación de enlaces covalentes para la purificación de proteínas, reversible bajo condiciones que no causen pérdida de actividad. Se restringe al uso de matrices que contienen grupos tiol que forman puentes disulfuro mixtos con proteínas que tengan grupos tiol.

Elección de la Matriz

La introducción de grupos tioles confiere características particulares al derivado tiólico.

Grado de Sustitución

Cantidad de grupos tiol introducidos. Se hace reaccionar el grupo tiol con un compuesto de bajo peso molecular para calcular cuánto se puede unir. La capacidad práctica se calcula en función de la cantidad de proteína que se puede unir en condiciones reales, siendo inferior al grado de sustitución debido al impedimento estérico.

Activación de Grupos Tiol

Se utilizan disulfuros como 2,2′-dipiridilo (ditio piridina) para la formación de un grupo disulfuro mixto entre la matriz y el reactivo, liberando 2-tiopiridona, que se mide a 343 nm.

El flujo de aplicación de la muestra debe ser lento para permitir la formación de puentes disulfuro mixtos. La mayoría de las proteínas lo forman a pH 8, excepto las que tienen grupos tiol con pKa bajo (cisteinproteinasas), que lo forman a pH 4.

Si la proteína no tiene grupos tiol, se introducen con N-acetil homocisteína tiolactona, que reacciona espontáneamente con grupos amino (Lys y N-terminal). Las matrices también reaccionan con compuestos CO, CC, CN, metales pesados y haluros de arilo.

Lavado y Elución

Se lavan las proteínas que no se hayan unido y que estén absorbidas de forma inespecífica. Finalizado el lavado, la columna se equilibra con el tampón que se empleará para la elución de la proteína de interés.

La elución reductiva se realiza incluyendo en el tampón de elución un compuesto que tenga tioles libres, dando al medio carácter reductor (ditiotreitol, β-mercaptoetanol, cisteína). Debido a la diferencia de tamaño entre la proteína y estos compuestos, es común la ultrafiltración.

Reactivación de la Matriz

Se lava abundantemente con un tampón que contenga ditiotreitol para reducir el resto de puentes disulfuro. Después, se hace reaccionar con ditiopiridina. Finalizada la activación, se lava y la matriz activada se reutiliza.