Replicación del ADN

Replicación en E. coli

Es semiconservativa, con un único origen de replicación, bidireccional, y tiene lugar en dirección 5′-3′. Se distinguen dos hebras: una continua o conductora (síntesis en el sentido de la horquilla de replicación) y otra rezagada (sentido opuesto a la horquilla de replicación).

En el proceso intervienen las siguientes enzimas y proteínas:

• ADN A: Abre la cadena en sitios específicos (OriC).
• ADN B: Helicasa, desenrolla el ADN.
• ADN C: Ayuda a que el ADN B se una.
• HU: Proteína tipo histona, ayuda al inicio de la replicación, se une a la secuencia tándem y curva el ADN.
• ADN D: Primasa, ayuda a que se forme el cebador.
• SSB: Impide la unión de las dos hebras.
• ARN polimerasa: Ayuda a ADN A.
• Topoisomerasa: Libera la tensión que se produce cuando se abre la hélice.
• Helicasa: Abre la cadena.
• OriC: Secuencia de 245 pares de bases con secuencias clave.
• Dam metilasa: Metila las secuencias (5′)GATC en OriC.
• ADN girasa: Desenrolla el ADN.

Inicio:

1. ADN A reconoce OriC, abre la doble hélice y se une al sitio específico.
2. HU curva el ADN y estimula el inicio.
3. ADN B desenrolla el ADN con la ayuda de ADN C y ADN girasa.
4. SSB estabiliza el ADN y la Dam metilasa metila las secuencias (5′)GATC en OriC.

Elongación:

• Síntesis de la cadena conductora: ADN D (primasa) sintetiza cebadores de ARN en el OriC y la ADN polimerasa III adiciona desoxirribonucleótidos a este cebador. La síntesis de la hebra continua transcurre de manera continua al mismo ritmo que el desenrollamiento del ADN en la horquilla de replicación.
• Síntesis de la hebra rezagada: Se realiza a trozos y necesita un primosoma: primasa (cebador) y helicasa (desenrolla). La primasa sintetiza un cebador de ARN y la ADN polimerasa III se une a este y añade desoxirribonucleótidos. Se necesita un cebador por cada fragmento de Okazaki, ya que, como la síntesis tiene lugar en sentido contrario a la horquilla de replicación, la ADN polimerasa se detiene hasta que se vuelve a abrir la horquilla y se sintetiza un nuevo cebador. La ADN polimerasa cambia el ARN cebador por ADN y la ligasa sella los fragmentos.

Terminación: Finalmente, la horquilla de replicación llega a la secuencia Ter y se forma el complejo Ter-Tus, terminando así la replicación.

Replicación en eucariotas

• Muchas horquillas de replicación, cada una copia en dirección 5′-3′.
• Las dos hebras de ADN se abren por actividad helicasa y la proteína RFA se une a la monohebra para mantenerla abierta.
• RFA ayuda a la polimerasa α a formar el cebador en ambas hebras y la PCNA se une para inhibir a la polimerasa α, inhibiendo la elongación del cebador.
• Aparece la polimerasa γ que sintetiza la cadena continua y la polimerasa α lo hace en la rezagada.
• Existe un problema de síntesis en los extremos de la hebra rezagada.
• La ADN polimerasa I se encarga de unir los fragmentos de Okazaki sustituyendo los extremos de ADN, acortándose los telómeros, lo que provoca alteraciones. Esto no sucede gracias a las enzimas telomerasas, que se encargan de la replicación de los extremos lineales en eucariotas. Antes de que empiece la replicación, las telomerasas se fijan en los extremos 3′ y añaden una secuencia de nucleótidos extra gracias a que en su interior tienen un molde de ARN complementario a las secuencias teloméricas ricas en T y G, llamadas secuencias teloméricas. Las telomerasas solo las poseen las células germinales, por eso las células somáticas van perdiendo nucleótidos.

Replicación mitocondrial

El ADN mitocondrial consta de dos hebras, una pesada (H) y otra ligera (L). Una zona del ADN recibe el nombre de bucle D, región no codificante que desempeña el papel de región de control, pues contiene el origen de replicación de la hebra H y los orígenes de transcripción de ambas. Por replicación de un trozo de hebra empleando la hebra L, se forma una triple hebra (ADN 7s). La elongación de la nueva H desplaza a la H de su apareamiento con la L progenitora. Tras recorrer 2/3 del cromosoma, el origen O_L queda accesible y puede comenzar la síntesis de una nueva hebra ligera L usando la H progenitora como molde. Entonces se completa la replicación de ambas hebras. Su avance es unidireccional mediante dos horquillas de replicación que parten de orígenes distintos y avanzan en sentido opuesto, sintetizando una sola hebra cada una. Se diferencia de la replicación nuclear por ser no simultánea, bifocal y continua (no se forman fragmentos de Okazaki).

Reparación del ADN

La importancia de mantener una copia “sana” del material genético para la célula ha hecho que se desarrollen estrategias para reparar los daños que se producen de manera constante en el ADN. La etapa más importante del proceso es aquella en la que se detecta el punto o puntos del genoma donde se localiza la alteración. Una de las condiciones para que esto se pueda llevar a cabo es que la molécula de ADN se encuentre descompactada, lo que permitiría al sistema de detección “rastrear” dicha región en busca de errores, que se localizarían por la distorsión estructural que un apareamiento de bases incorrecto produce en el dúplex. La reparación es posible gracias a que las hebras son complementarias.

• Reparación de apareamientos incorrectos: Se discrimina entre la cadena molde y la recién sintetizada marcando el ADN molde con grupos metilo. La Dam metilasa metila el ADN en la posición N6 de todas las adeninas presentes en las secuencias 5′-GATC. Se forma el complejo MutL-MutS que se une a todos los pares de bases mal apareados. MutH (endonucleasa con actividad de secuencia) cataliza el corte de la cadena no metilada por el extremo 5′ de la G del GATC, marcando de este modo la hebra que se va a reparar. Para ello, MutH se une a MutL del complejo. Si el desapareamiento está en el lado 5′ del sitio de corte, se desenrolla y degrada la hebra sin metilar en sentido 3′-5′, reemplazándose por un nuevo ADN con la ayuda de ADN helicasa II, SSB, exonucleasa I, ADN polimerasa III y ADN ligasa. Si el desapareamiento está en el lado 3′ del sitio de corte es similar, pero la exonucleasa VII reemplaza a la exonucleasa I.
• Reparación por escisión de bases: La ADN glucosilasa reconoce lesiones muy frecuentes en el ADN, tales como la desaminación de citosinas (da uracilos) y adeninas, eliminándose la base afectada rompiendo el enlace N-glucosílico, resultando un sitio apurínico o apirimidínico en el ADN denominado sitio AP. Una vez formado este, las enzimas AP endonucleasa lo reparan cortando y eliminando el sitio AP de la cadena de ADN y la ADN polimerasa I lo reemplaza y la mella es sellada por la ADN ligasa. Cada ADN glucosilasa es específica para cada tipo de lesión.
• Reparación por escisión de nucleótidos: Un enzima multimérico hidroliza dos enlaces fosfodiéster, uno a cada lado de la lesión. El oligonucleótido limitado por las lesiones es liberado del dúplex y el hueco resultante es rellenado por la ADN polimerasa I en E. coli y por la ADN polimerasa ε en eucariotas. La mella es reparada por la ADN ligasa. En E. coli el complejo enzimático clave es la ABC excinucleasa, formado por tres proteínas (UvrA, UvrB y UvrC). Estas proteínas se fijan en la lesión del ADN, cortan un trozo del ADN (13 pares de bases), 8 pares de bases en el extremo 5′ y 4 o 5 pares de bases en el otro lado.
• Reparación directa: Ocurre cuando hay dímeros de timina o bases metiladas. Si hay dímeros de timina que se forman por la luz ultravioleta, son reparados por la ADN fotoliasa que tiene un grupo cromóforo que recoge la luz ultravioleta a una determinada λ y el grupo cromógeno (FADH) absorbe la luz formando FAD y cediendo los electrones al dímero de timina provocando que se rompa. Si hay bases metiladas, se produce una desmetilación por la ADN metiltransferasa.

Recombinación del ADN

Se puede definir como cualquier proceso en que tenga lugar la formación de un nuevo ADN a partir de moléculas distintas, de manera que la información genética procedente de cada molécula de ADN original estará presente en las nuevas. Ejemplos en que ocurre la recombinación:

• Meiosis en células eucarióticas.
• Infección de plásmidos o virus.
• Integración de elementos extracromosomales dentro del genoma hospedero.

La recombinación constituye una fuente de variabilidad genética e intercambio físico de segmentos. Tiene valor regulatorio, ya que puede tener como resultado la activación o inactivación de genes y es, además, una vía de reparación.

• Recombinación homóloga: Es un proceso de reorganización entre dos moléculas de ADN o en la misma molécula que requiere secuencias homólogas. Se produce durante la meiosis o después de la replicación. Las moléculas del ADN se acercan y se alinean. A continuación, se produce un corte de doble cadena en uno de los dos homólogos que se convierte en un hueco de cadena doble por la acción de las exonucleasas. Las hebras con extremos 3′ se degradan menos que las que tienen 5′, formándose extensiones 3′ de cadena sencilla. Los extremos 3′ libres invaden el ADN dúplex intacto, a continuación se produce la migración de la ramificación y/o la replicación que crea un par de estructuras entrecruzadas (intermediario de Holliday). La resolvasa corta el intermediario y produce dos productos de recombinación.
• Recombinación específica de sitio: Aquella que tiene lugar entre moléculas distintas de ADN. Hace falta una secuencia específica y un enzima recombinasa que tiene actividad nucleasa y ligasa. La recombinasa tiene una serina o una tirosina que se va a fosforilar gracias al grupo fosfato del ADN. El grupo OH de la Tyr ataca al fosfato del ADN y lo corta. Las hebras cortadas se unen unas a otras formando el intermediario de Holliday y se unen las mellas.
• Transposición: Los transposones son elementos de ADN presentes en todas las células y que saltan de un lugar a otro (retrotransposones en eucariotas). En bacterias se distinguen entre simples, si contienen las secuencias terminales y el gen de la transposasa, o complejos, si contienen además el gen de resistencia. Mecanismo: Hay dos vías para la transposición, simple y replicativa. En ambas, el primer paso es el del corte del ADN a cada lado del transposón. A continuación, los grupos 3′ OH liberados en los extremos del transposón actúan como nucleófilos en un ataque directo sobre los enlaces fosfodiéster del ADN diana. El transposón se encuentra ahora unido al ADN diana. A continuación, en la transposición directa, la replicación llena los huecos en cada extremo y en la replicativa, se replica el transposón entero formándose un intermedio cointegrado. Después, en la transposición directa se rellena el hueco con la ADN polimerasa y se une con la ADN ligasa. En la replicativa, se corta el cointegrado con ayuda de otro sistema de recombinación específica de sitio.

Transcripción

Solo se necesita una cadena molde para sintetizar ARN. Sigue la regla de apareamiento de bases, solo que donde hay T se pone U. La ARN polimerasa transcribe en dirección 5′-3′ y no necesita cebador. Gracias a las secuencias reguladoras se sabe dónde empieza y dónde acaba el gen.

• Inicio: La ARN polimerasa se une al promotor en el extremo 5′ del gen, este tiene dos secuencias consenso reconocidas por la subunidad δ en -10 (5′-TATAAT-3′) y en -35 (5′-TTGACA-3′) y un elemento UP rico en A y T, donde se une la subunidad α. Se forma un complejo cerrado y un complejo abierto. Empieza la elongación cuando se han sintetizado 8 o 9 nucleótidos del nuevo ARN, la subunidad δ es liberada y la polimerasa abandona el promotor.
• Elongación: Modelo de burbuja: La región del ADN cambia de manera discontinua, lo cual sugiere que la enzima en contacto sufre una translocación a lo largo del ADN en saltos de varios nucleótidos. Modelo de gusano: La polimerasa avanza encogiéndose y extendiéndose, y el ARN se mantiene.
• Terminación:
  • Independiente de rho: En el ADN hay una secuencia STOP, secuencia palindrómica rica en G y C seguida de 4-10 A en la hebra y cuando la ARN polimerasa llega, se detiene.
  • Dependiente de rho: No hay secuencia STOP, el factor rho se une al transcrito sintetizado, requiriendo ATP, se mueve en sentido 5′-3′ hasta que encuentra el bucle de transcripción.

Maduración del ARN

Proceso postranscripcional, no se da en procariotas.

1. Modificación del extremo 5′: Justo después del inicio de la transcripción.
   • a) Formación de la caperuza 5′: Se produce la desfosforilación del extremo 5′ del transcrito primario por la fosfatasa y la guanililación del extremo 5′ del transcrito primario por la ARNm guanililtransferasa.
   • b) Metilación de la caperuza 5′: La metiltransferasa modifica los tres primeros nucleótidos de la estructura 5′-guanosina-trifosfato-ARNm empleando 5-adenosil-2-metionina. Tres tipos de caperuza: si la metilación es en N-7 de la guanosina terminal, caperuza 0; si además la metilación es en 2′-OH de la ribosa adyacente, caperuza 1; y si además es en 2′-OH de la ribosa siguiente, caperuza 2.
2. Modificación del extremo 3′: Las polimerasas cortan por medio de endonucleasas el ARN 10 o 30 nucleótidos antes de que termine la síntesis y el transcrito primario es liberado. Se produce una poliadenilación del extremo 3′ por medio de la poli-A polimerasa que añade (AAUAAA) formando la cola de poli-A que se aprovecha para la purificación del ARNm.
3. Eliminación de intrones y simultáneo empalme de exones: Solo se da en transcritos primarios con intrones, que son regiones que no codifican aminoácidos. Los intrones tienen secuencias de unión a exones que empiezan por GU y terminan por AG. Supone la ruptura de dos enlaces fosfodiéster y la formación de uno nuevo entre dos exones en una reacción de transesterificación.

Tipos de intrones

• Tipo I (ARNr: nucleares, mitocondriales y cloroplásticos): No requiere de ATP en el corte y empalme, requiere de guanosina. El extremo 3′-OH de la guanosina actúa como nucleófilo atacando al fosfato en el sitio 5′ de corte y empalme y el extremo 3′-OH del exón 5′ se convierte en nucleófilo completando la reacción.
• Tipo II (ARNm: mitocondrial y cloroplásticos): No requiere ATP. El extremo 2′-OH de una adenosina específica del intrón actúa como nucleófilo atacando el sitio de corte y empalme 5′ para formar un lazo. El extremo 3′-OH del exón 5′ actúa como nucleófilo completando la reacción.
• Tipo III (ARNm: nuclear y genes estructurales): No requiere ATP. Sigue el mecanismo de lazo tipo II catalizado por la ribonucleoproteína.
• Tipo IV (ARNt): Requiere ATP y el mecanismo es distinto para cada tipo de ARNt.

Traducción

Traduce ARNm a proteínas, en dirección 5′-3′ y es unicatenal.

• Inicio: Se lleva a cabo con la formación del complejo de inicio que tiene tres etapas.
  • Etapa 1: La subunidad ribosómica 30S une los factores de inicio IF1 y IF3 (impide que se unan prematuramente 30S y 50S). Después el ARNm se une a la subunidad 30S y el iniciador 5′-AUG es guiado hasta su posición correcta por la secuencia de Shine-Dalgarno del ARNm, señal de inicio que se encuentra en el lado 5′ del codón de inicio. Los sitios donde se fija el aminoacil-ARNt son el aminoacilo (A), el peptidilo (P) y el de salida (E). Los sitios A y P se encuentran tanto en la subunidad 30S como en la 50S, mientras que el sitio E solo está en la 50S. El 5′-AUG se sitúa en el sitio P.
  • Etapa 2: El complejo formado por 30S, IF3 y el ARNm se une a IF2 ligado al GTP y al aminoacil-ARNt iniciador. El anticodón de este ARNt se aparea con el codón de inicio.
  • Etapa 3: Este gran complejo se combina con la subunidad 50S, al mismo tiempo que el GTP unido a IF2 se hidroliza a GDP y Pi que se desprenden del complejo. Los factores de inicio abandonan también el ribosoma y se produce entonces un ribosoma 70S funcional llamado complejo de inicio que contiene ARNm y el iniciador aminoacil-ARNt.
• Elongación: El complejo de inicio coloca el aminoácido correspondiente al codón de inicio, en ese momento otro aminoacil-ARNt se une al complejo leyendo el siguiente codón y colocando el correspondiente aminoácido, formándose el enlace peptídico entre los aminoácidos, liberándose el primer aminoacil-ARNt, y así sucesivamente.
• Terminación: Ocurre cuando el complejo encuentra un codón STOP, entonces se detiene la traducción, se une el factor de liberación, se hidroliza el enlace peptidil-ARNt y se disocian los componentes del complejo.

Editing

Modificación del marco de lectura de ARNm. Establecido un marco de lectura durante la síntesis de proteínas, los codones se traducen ordenadamente hasta que el codón de terminación queda sin solapamiento. Algunos genes están estructurados de tal manera que los ribosomas en el punto dado de la traducción del ARNm cambian de marco de lectura y la traducción se lleva a cabo hasta el codón de terminación (UAA, UAG, UGA) donde esta se detiene pero no termina, dando tiempo a que se desplace el codón un residuo, formándose un nuevo codón y con él un nuevo marco de lectura. Es un mecanismo utilizado para producir dos o más proteínas relacionadas, a partir de un mismo transcrito, como para regular la síntesis.

Telomerasas

Siempre que se replica ADN cromosómico, las cadenas hijas son un poco más cortas por el extremo 5′. Si no se compensa este defecto, los cromosomas se acortarían. Las telomerasas portan su propio molde para sintetizar ADN telomérico, cadena rica en C y G. Agregan nucleótidos complementarios a los del molde. Las telomerasas se fijan en los extremos 3′ del ADN antes de que comience la replicación y con su molde añaden a este secuencias de nucleótidos extras (secuencia telomérica) a cada cadena parental. Las cadenas parentales se separan y se produce la replicación. Se eliminan los cebadores y se rellenan los huecos internos.

Topoisomerasas

Enzimas que modifican la ligazón del ADN sin modificar su estructura en otros aspectos. Alivian la tensión por encima de la horquilla rompiendo transitoriamente las hebras de ADN, y permiten que se vuelvan a formar los enlaces fosfodiéster en la ruptura de las hebras. Dos tipos:

• Topoisomerasa I: Rompe una sola de las dos hebras. Se mantiene unida covalentemente al extremo 5′ de la hebra rota, formando un enlace fosfodiéster entre el fosfato 5′ y un hidroxilo de la tirosina. El extremo 3′ queda libre para girar. El grupo hidroxilo 3′ ataca luego al fosfato 5′ actuando unido covalentemente, cerrando la mella. En eucariotas es igual, pero el 3′ queda inmovilizado durante la reacción.
• Topoisomerasa II: Cataliza una ruptura de la doble hebra, y la parte no rota de la misma atraviesa el hueco creado. Se denomina ADN girasa.