Requerimientos Nutricionales y Ambientales para el Cultivo de Microorganismos

Nutrición Microbiana

Los microorganismos son muy exigentes en cuanto a los requerimientos nutricionales para su crecimiento y desarrollo. El conjunto de procedimientos determinados a aportar los factores ambientales y nutricionales necesarios para inducir el crecimiento de los microorganismos se denomina cultivo.

Los medios de cultivo son, por tanto, las preparaciones nutritivas que nos sirven para entregar a los microorganismos todos los factores que garanticen su crecimiento. Estos factores son:

1. Factores Nutricionales

Fuente de energía
Fuente de carbono
Fuente de nitrógeno
Fuentes minerales
Fuente vitamínicas, etc.

Carbono

Este elemento puede aportarse a los microorganismos en forma muy diversa dependiendo del tipo de metabolismo que posean. El carbono es utilizado por los microorganismos para sintetizar los compuestos orgánicos requeridos para las estructuras y funciones de la célula. Los microorganismos se pueden dividir en categorías nutricionales en base a dos parámetros: naturaleza de la fuente de energía y naturaleza de la fuente principal de carbono.

Categorías Nutricionales

Fotótrofos: Utilizan luz como fuente de energía.
Quimiótrofos: La fuente de energía es química.
Autótrofos: Utilizan como fuente de carbono el CO₂ a partir del cual sintetizan los esqueletos carbonados de los metabolitos orgánicos.
Heterótrofos: Utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono y electrones.

Combinando estos parámetros podemos establecer cuatro categorías principales de microorganismos:

Fotoautótrofos: Dependen de la luz como fuente de energía y utilizan CO₂ como principal fuente de carbono. (Vegetales superiores, bacterias fotosintéticas, algas eucarióticas, etc.)
Fotoheterótrofos: Utilizan luz como fuente de energía y emplean compuestos orgánicos como fuente de carbono. (Algunas bacterias fotosintéticas y algas eucarióticas)
Quimioautótrofos: Utilizan CO₂ como fuente de carbono y emplean como fuente de energía química generalmente de compuestos inorgánicos reducidos (H₂, S^2-, NH₄⁺, etc).
Quimioheterótrofos: Utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono y energía, los compuestos orgánicos también se comportan como fuente de electrones. (Animales superiores, hongos, protozoos y la mayoría de las bacterias)

Nitrógeno

El Nitrógeno es utilizado por las bacterias para formar aminoácidos, bases nitrogenadas (púricas y pirimídicas), etc. Y puede provenir de diferentes fuentes:

Asimilación de NH₃ y sales de amonio: El nitrógeno es transferido en éste estado de oxidación a los aminoácidos por la vía del glutamato/glutamina.
Fijación del Nitrógeno: El nitrógeno es reducido dentro de la célula a NH₄⁺ y metabolizado. (SIMBIÓTICAS: Gén. Rhyzobium ASIMBIÓTICAS: Gén. Beyerinkia y Gén. Azotobacter)
Reducción asimiladora de nitratos: Los nitratos son reducidos dentro de la célula por la vía de los nitritos a NH₃ y metabolizados.
Hidrolizados proteicos: Los microorganismos incapaces de asimilar el nitrógeno de sales inorgánicas lo obtienen a través de compuestos orgánicos nitrogenados como hidrolizados proteicos. Estos compuestos protéicos son a su vez hidrolizados por enzimas bacterianas, fuera de la célula, a aminoácidos, los que después son metabolizados dentro de la célula.

Oxígeno

Basados en los requerimientos de oxígeno molecular los microorganismos se pueden dividir en 5 grupos:

Aerobios obligados: Requieren oxígeno para el crecimiento pues dependen de éste elemento para cubrir sus necesidades energéticas. El oxígeno es el aceptor final de electrones en la Cadena Respiratoria.
Anaerobios obligados: Crecen en ausencia total de oxígeno porque necesitan un medio muy reductor, los aceptores finales de electrones pueden ser sulfatos, carbonatos, fumaratos, etc. Para lograr en el laboratorio anaerobiosis estricta se utiliza Campana de Anaerobiosis con inyectores de nitrógeno, CO₂ y el más usado es el GasPack.
Anaerobios facultativos: Pueden crecer en presencia o ausencia de oxígeno. Utilizan al oxígeno como aceptor final de electrones en la Cadena Respiratoria cuando está disponible y en ausencia de oxígeno la energía la obtienen por fermentación o respiración anaeróbica (generalmente el NO₃^– es el aceptor final de electrones en las Enterobacterias).
Anaerobios aerotolerantes: Pueden crecer en presencia o ausencia de oxígeno pero la energía la obtienen por fermentación.
Microaerófilos: Sólo pueden crecer con bajas tensiones de oxígeno porque las altas tensiones son tóxicas para éste tipo de microorganismo (1 a 12% de O₂ en la fase gaseosa). La energía la obtiene por respiración aeróbica, cuando no hay aceptores electrónicos terminales alternativos o anaeróbica. Las condiciones para el crecimiento de bacterias microaerófilos se logra por una sencilla técnica llamada “Método de la Vela”.

Azufre

El azufre puede entrar a la célula reducido (grupos sulfidrilos), como sulfatos (debe ser reducido dentro de la célula para metabolizarse) o como aminoácidos azufrados (cisteína o metionina). El azufre es utilizado para la síntesis de aminoácidos como la cisteína o metionina, que tienen un papel muy importante en la estructura terciaria de las proteínas (formación de puentes S-S) y en el sitio catalítico de enzimas.

Factores de Crecimiento

Son compuestos orgánicos que los microorganismos son incapaces de sintetizar a partir de los nutrientes y son fundamentales para la maquinaria metabólica celular. Son vitaminas, aminoácidos, bases púricas y pirimidínicas, etc. En relación al requerimiento de factores de crecimiento, los microorganismos se pueden dividir en:

Protótrofos: Microorganismos que sintetizan sus propios factores de crecimiento.
Auxótrofos: Microorganismos que requieren una fuente exógena de factores de crecimiento debido a que son incapaces de sintetizarlos.

Iones Inorgánicos

Son esenciales para el crecimiento porque estabilizan enzimas, ribosomas, membranas, etc. Deben ser aportados en el medio de cultivo a través de sales que contienen K⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺, Na⁺, Fe²⁺, Fe³⁺ y trazas de Cu²⁺, Co²⁺ y Zn²⁺.

2. Factores Ambientales

Temperatura
pH
Aireación
Presión osmótica
Concentración salina
Tensión superficial, etc.

pH del Medio

(Se puede ajustar con buffer KH₂PO₄ / K₂HPO₄). La mayoría de los microorganismos crecen alrededor del pH fisiológico (pH = 7), pero de acuerdo al pH los microorganismos pueden ser:

Acidófilos: (crecen en un rango de pH entre 1 a 5,5).
Neutrófilos: (de 5,5 a 8,5).
Basófilos: (de 8,5 a 14).

Temperatura

No todos los microorganismos exigen las mismas temperaturas para su crecimiento y desarrollo, de acuerdo a su temperatura de crecimiento estos pueden ser:

Psicrófilos: (14ºC a 20ºC).
Mesófilos: (20ºC a 40ºC).
Termófilos: (40ºC a 60ºC).

Aireación

(ver oxígeno) Aerobios obligados, anaerobios obligados, anaerobios facultativos, anaerobios aerotolerantes, microaerófilos.

Historia del Cultivo de Microorganismos

(Schoeter 1872 microbiólogo) Observó formación de masas aisladas sobre la superficie de rodajas de papas podridas. Utilizando este principio, se comenzaron a utilizar soluciones de un derivado de las algas (Gelidium sp) llamada agar-agar que tiene la propiedad de disolverse a 100ºC y formar un gel a 45ºC, lo que garantiza superficies «sólidas» transparentes y nutritivas, en placas de petri principalmente.

Métodos de Cultivo

Definiciones

Inóculo: Tomar una muestra de una cierta cantidad de material infeccioso o contaminación para ser depositado sobre un medio de cultivo.
Siembra: Acto de colocar un inóculo sobre un medio de cultivo.
Resiembra: (Subcultivo) Traslado de microorganismos de una sola colonia de un medio de cultivo a otro.
Colonia: Masa aislada formada por un conglomerado de millones de microorganismos de una misma especie que es posible ver a simple vista y se desarrollan en medios de cultivos sólidos a partir de una sola célula, y con características propias de cada especie.
Estriar: Rayar la superficie del medio de cultivo delicadamente en todos los cuadrantes, lo que permite extender el inóculo y obtener colonias por separado.
Cultivos mixtos: Son aquellas que provienen de muestras que poseen gran variedad de microorganismos. Ej. muestras fecales, nasales, tierra, faríngeas, etc.
Cultivos puros: Son aquellos formados por una sola cepa microbiana, estos se pueden lograr por diferentes técnicas (Joseph Lister, 1878, obtuvo por primera vez cultivos puros de bacterias por diluciones seriadas en medios líquidos con muestra de leche, B. Lactis), como:

Técnicas de Cultivo Puro

Técnica de siembra por estrías en placas y técnica por difusión en placas: Esta es una técnica de rutina diaria en microbiología, consiste en sembrar una muestra sobre una superficie de un medio de cultivo sólido en placa de petri, la siembra por estrías se realiza con asa de platino y se hace con una sola asada dando pases en los 4 cuadrantes de la placa; y la siembra por difusión es la extensión de una muestra casi siempre líquida tratando de cubrir toda la superficie de la placa con varilla de cristal especial que le llamamos rastrillo (espátula de Drigalski). En ambos casos el objetivo de esta técnica es obtener colonias separadas para posterior resiembra y así poder obtener cultivos puros.
Técnica de la placa vertida: Para esta técnica se utilizan los medios sólidos a 45ºC (todavía en estado líquido) y se le agrega una proporción de suspensión de bacterias en la propia placa agitando suavemente el mismo para unificar la muestra. Se saca una asada a otro medio de cultivo estéril, se agita y de éste se vuelve a sacar otra asada a otro tubo de medio de cultivo igual estéril, estos tres tubos se vierten en placas de petri estériles, se incuban 37ºC-24 horas, al cabo de este tiempo obtendremos colonias de ellas. Se hacen resiembras para así obtener cultivos puros.
Técnica de enriquecimiento de cultivo: Para esta técnica se utilizan medios de enriquecimiento, estos medios se usan generalmente cuando el tipo de bacteria que queremos aislar se encuentran en muy pequeñas cantidades en la muestra o se desarrolla con mayor lentitud que muchas de las otras especies presentes.
Técnica de las diluciones en serie: Si el microorganismo que se busca en cultivo se encuentra en un cultivo mixto, pero en mucha mayor cuantía que los demás es posible mediante una serie de diluciones en tubo con medios de cultivos apropiados aislar el mismo. Cuando la muestra esté muy diluida contendrá solamente las bacterias que buscamos aunque es recomendable realizar siembras en placa.
Técnica de aislamiento de una sola célula: Para esta técnica especial se utiliza un equipo llamado micromanipulador el cual se adapta a un microscopio óptico, se extrae una sola célula bacteriana y se pasa a un medio de cultivo adecuado. Es una técnica que sólo se utiliza para trabajos sofisticados de investigación las cuales deben ser muy exactos y con un operador experimental.

Clasificación de los Medios de Cultivo

Los medios de cultivo se clasifican según su composición, consistencia y funcionalidad.

A) Composición

Medios Inanimados Naturales o Empíricos: Medios de cultivos a los se desconoce su composición exacta. Ejemplos: leche, huevo, carne, jugos, etc.
Medios Inanimados Sintéticos o Definidos: De composición exactamente conocida por lo que pueden ser reproducibles en el Laboratorio. Ejemplo:
- Peptona ——10g
- Dextrosa —–10g
- Agar ———–10,5g
- Agua (d) —— 1000ml
Medios Vivos: Son medios que responden a microorganismos que necesitan vivir intracelularmente o en tejidos vivos. Ejemplos: ratones lactantes, cultivos de tejidos, embriones de pollo, etc.

B) Consistencia

Medios líquidos: Son caldos de cultivos por lo que no contienen agar, generalmente se envasan en tubos de ensayos estériles. Ejemplo: Caldo Nutritivo, Caldo de Corazón, etc. En éstos medios el crecimiento bacteriano lo indica el grado de turbidez del medio.
Medios sólidos: Son medios de cultivos agarizados distribuidos generalmente en Placas de Petri estériles pero también se pueden envasar en tubos con superficie plana o en cuñas. Ejemplo: Agar Nutriente, Agar Sangre, Agar Sabouraud, etc.
Medios semisólidos: Son medios con bajas concentraciones de agar por lo que su consistencia es como una gelatina blanda, se distribuyen en tubos estériles. Ejemplos: Medio Selenito, Medio de Transporte, etc.

C) Funcionalidad

Medios de enriquecimientos: Son aquellos medios en que se favorece las exigencias nutricionales de algunos microorganismos. Ejemplo: Agar Sangre, Agar Chocolate, etc.
Medios Selectivos: Medios en que se favorece el desarrollo de determinado microorganismo ya que contienen sustancias inhibidoras para los demás. Ejemplo: Agar SS, Agar Endo, etc.
Medios Diferenciales: Medios generalmente sólidos que imparten alguna característica distintiva a las colonias de algunos microorganismos por medio de la cual podemos fácilmente identificarlos. Ejemplo: Agar Mc Conkey, Agar Levine, etc.