Examen Práctico Biología – Respuesta Propuesta
El ratón NOD es un modelo utilizado para el estudio de la diabetes tipo 1. Se ha demostrado que, utilizando un tipo de células madre derivadas de médula ósea, es posible revertir la patología. Para ello, se usaron células derivadas de un ratón que expresa la proteína verde fluorescente (GFP). A continuación, se describe cómo averiguar el mecanismo de acción de estas células utilizando las tres estrategias presentadas en las prácticas de la asignatura (inmunohistoquímica, citometría de flujo y proteómica). Se detallan las herramientas para demostrar la efectividad del tratamiento en comparación con otro ratón NOD que no ha recibido el tratamiento.
Citometría de Flujo
Para evidenciar el éxito del tratamiento con esta estrategia, se parte de dos muestras: una del ratón NOD tratado y otra del ratón NOD no tratado. En ambas preparaciones, se introduce un anticuerpo asociado a un fluorocromo específico de la insulina de ratón, con una longitud de onda de fluorescencia diferente a la de la GFP. Dado que el valor a estudiar (presencia de insulina) es intracelular, se debe permeabilizar la membrana y fijarla con formaldehído para que el anticuerpo pueda entrar. Se ajusta la longitud de onda del citómetro de flujo al fluorocromo escogido y se pasan las células de ambas preparaciones por el aparato, utilizando el flujo laminar aspirado a través del cañón de luz para estudiar la fijación de los anticuerpos.
En el caso de las muestras del ratón tratado, se observará en el histograma una señal positiva (entre 104 y 105 unidades) de anticuerpos unidos a insulina. En las células del ratón NOD no tratado, la señal será negativa. Esto demuestra que, en el ratón tratado, las células madre derivadas producen insulina y, por lo tanto, son útiles para tratar la diabetes tipo 1.
Proteómica
En proteómica, se utiliza un marcador biológico para determinar si las células trasplantadas son funcionales (es decir, producen insulina). Se obtiene una muestra de orina o sangre de ambos ratones (el tratado y el diabético no tratado) y se utiliza espectrometría de masas para separar las proteínas presentes. Se comparan ambas muestras con los valores de normalidad de un ratón no diabético, obtenidos de bases de datos bioinformáticas.
Si el proteoma del ratón NOD tratado es similar al de un ratón normal (especialmente en las proteínas relacionadas con el control de la glucemia, identificadas mediante herramientas como String), mientras que el del ratón enfermo no tratado presenta una disminución en los valores de insulina, se demuestra la funcionalidad del trasplante celular. Además de la proteómica, se consideran la genómica, transcriptómica y metabolómica. Esto permite analizar, por ejemplo, los diferentes genes que se expresan para la síntesis de insulina, observando que en las células trasplantadas se expresa la síntesis de insulina y que, por lo tanto, son funcionales.
Inmunohistoquímica
El primer paso es obtener islotes beta de ambos ratones en cultivo: un cultivo (a) con células del ratón NOD tratado y otro (b) con células del ratón no tratado. Para la experiencia, se rocían las muestras con agua oxigenada para eliminar cualquier peroxidasa endógena (la enzima utilizada para el marcaje). Luego, se añade una primera tanda de anticuerpos monoclonales específicos anti-insulina a ambos cultivos (que se unirán a las moléculas de insulina). Se fijan y se añade una segunda tanda de anticuerpos secundarios anti-anti-insulina asociados a peroxidasas exógenas. Estos reconocerán los anticuerpos primarios y se unirán a ellos, quedando anclados a la insulina de las células madre derivadas. Esto solo sucederá en el primer cultivo, que contiene las células madre del tratamiento.
Posteriormente, se añade la mezcla de revelado (un donante de electrones como DAB diluido en agua oxigenada). En las células con anticuerpos secundarios asociados a peroxidasas, estas reducirán el agua oxigenada, oxidando el DAB, que formará un complejo que precipitará con un color marrón visible al microscopio. Antes de la observación, se lavan las preparaciones con agua, se contrastan con hematoxilina, se deshidratan con alcoholes, se aclaran con xilol y se cubren con parafina. Estas “colonias” marrones solo serán visibles en la primera preparación (la que recibió el tratamiento, que implica la implantación de células exógenas productoras de insulina). En la segunda preparación, los anticuerpos con la peroxidasa no se habrán fijado y no se producirá la reacción de revelado. Se demuestra así que, en las células del ratón NOD tratado, se produce insulina (que permite la correcta absorción de glucosa desde el torrente sanguíneo hasta las células), lo que valida su uso para tratar la diabetes tipo 1.