Factores Clave en el Diseño de Scaffolds para Ingeniería Tisular

Los scaffolds, o andamios, son estructuras tridimensionales esenciales en ingeniería tisular, que proporcionan soporte y guía para la regeneración de tejidos. El diseño óptimo de un scaffold debe considerar varios factores críticos:

• Propiedades Mecánicas: La rigidez del scaffold, influenciada por su grado de entrecruzamiento, afecta la expresión génica y el fenotipo celular. La transmisión de señales mecánicas del entorno del scaffold a la célula es crucial.
• Presentación de Factores de Crecimiento: La correcta presentación de factores de crecimiento solubles, ya sea en la superficie o injertados en el scaffold, es fundamental para estimular la proliferación y diferenciación celular.
• Degradación: La tasa de degradación del scaffold debe sincronizarse con la secreción de la matriz extracelular (ECM) por parte de las células para evitar influencias no deseadas en la expresión génica.
• Adhesión Celular: El scaffold debe facilitar la interacción célula-ECM, principalmente a través de integrinas y otras proteínas de membrana como CD44 (en el caso del ácido hialurónico), para asegurar la correcta señalización celular.
• Topografía: La micro y nanoestructura superficial del scaffold modula la forma celular, el fenotipo y la secreción de una nueva ECM adecuada.

Mecanismos de Transducción de Señales Mecánicas

Las tensiones mecánicas se traducen en respuestas químicas a través de un proceso complejo que involucra:

1. Integrinas unidas a proteínas de la ECM y otras integrinas inactivadas.
2. Microfilamentos y microtúbulos del citoesqueleto de actina, que transmiten la fuerza y estimulan cascadas de señalización.

El modelo de tensegridad explica este proceso:

1. Aplicación de una fuerza externa en las integrinas.
2. Transmisión de fuerzas a los elementos del citoesqueleto.
3. Distorsión de filamentos y moléculas reguladoras.
4. Cambios conformacionales que alteran la función biofisiológica.

Estrategias para Mejorar el Crecimiento y la Vascularización en Scaffolds

Para optimizar la regeneración tisular, se emplean diversas estrategias:

• Modificación de Scaffolds:
  • Poros y gargantas de conexión grandes (200-400 micras) y altamente interconectados.
  • Modificación superficial con heparina u otras biomoléculas para anclar factores de crecimiento angiogénicos.
  • Scaffolds con microcanales que imiten la arquitectura vascular fisiológica.
• Incorporación de Factores de Crecimiento:
  • Inmovilización covalente en la superficie o embebidos en recubrimientos de colágeno.
  • Recubrimiento de poros con geles que contengan factores de crecimiento, microesferas o nanopartículas de liberación controlada.
  • Creación de geles de plasma rico en plaquetas (PRP) en los poros.
  • Factores clave: aquellos que promueven la invasión de células endoteliales, la formación de brotes vasculares y la maduración de capilares.
• Incorporación de Células Vasculares Proangiogénicas:
  • Células endoteliales: células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVECs), células endoteliales microvasculares dérmicas humanas.
  • Pericitos autólogos.

Uso de Células Diferenciadas en Ingeniería Tisular

Ventajas

• Ausencia de rechazo inmunológico si son autólogas.
• Función diferenciada específica para la regeneración del tejido diana (ej., condrocitos para cartílago).

Desventajas

• Cantidad limitada de células disponibles (obtenidas de biopsias).
• Mortalidad en el sitio de extracción.
• Capacidad de división limitada (dependiente del tipo de tejido y edad del paciente).
• Células dañadas en pacientes con enfermedades o degeneración.
• Desdiferenciación en cultivo in vitro debido a la dependencia del nicho celular. Es crucial reproducir las condiciones del nicho para mantener el fenotipo.

Biorreactores en Ingeniería Tisular

Los biorreactores son herramientas esenciales para dirigir in vitro el desarrollo de tejidos funcionales y estudiar los mecanismos de la función celular en condiciones fisiológicas relevantes. Son sistemas de cultivo dinámico que mimetizan las condiciones fisiológicas para mantener y promover el crecimiento celular.

Funciones Clave

• Control de calidad y estandarización para la fabricación GMP (Good Manufacturing Practices).
• Control de parámetros fisicoquímicos (temperatura, pH, oxígeno, nutrientes, metabolitos).
• Estandarización, automatización y escalado de la regeneración para aplicación clínica.
• Provisión de un ambiente 3D para la función celular y el desarrollo tisular.
• Provisión de señales reguladoras (factores de crecimiento, señales mecánicas, hidrodinámicas y eléctricas).
• Aumento de la transferencia de masa en los composites células/scaffolds.
• Siembra uniforme de células en el scaffold.
• Reducción de costes.

Componentes de un Biorreactor

• Cámara de cultivo (donde se aloja el scaffold).
• Reservorio de medio de cultivo.
• Sistema de intercambio de gases y medio.
• Instrumentación.

Requisitos Técnicos

• Biocompatibilidad.
• Esterilización fácil.
• Cámara adaptada al scaffold.
• Tubos y membranas de silicona.
• Permeabilidad a gases.
• Regulación de temperatura, pH y oxígeno.
• Estimulación física y/o eléctrica del scaffold.

Tipos de Biorreactores

• Biorreactor de Pared Rotatoria

  El scaffold flota en un cilindro. Las paredes externa e interna rotan a velocidad angular constante (15-30 rpm). El scaffold se mueve libremente, suspendido por el balance entre la fuerza gravitacional y la fuerza de arrastre hidrodinámica. El medio se puede renovar parando el biorreactor o automáticamente con una bomba.

• Biorreactor de Compresión o Tracción

  El biorreactor de compresión se usa en regeneración de cartílago articular, aplicando carga mecánica (dinámica o estática). Pistones aplican carga uniformemente a los scaffolds. La compresión dinámica provoca flujo de fluido a través del scaffold, favoreciendo la nutrición celular. Los biorreactores de tracción estimulan scaffolds a tracción dinámica para regenerar tendones, ligamentos, hueso o tejido cardiovascular. Se buscan diseños con múltiples réplicas.

• Biorreactor de Perfusión

  Es el más utilizado. Permite una siembra uniforme y una renovación continua del medio de cultivo, que se hace pasar a través de los poros del scaffold mediante una bomba. El flujo debe estar bien diseñado para equilibrar la transferencia de nutrientes, la extracción de desechos y la retención de la nueva matriz extracelular. Se puede diseñar un circuito para la siembra y otro para el cultivo a largo plazo.

  Siembra celular: Se utiliza una bomba peristáltica y un reservorio. El scaffold se encastra y se hace pasar la suspensión celular.

  Cultivo celular: Las células en suspensión concentrada se hacen pasar por el scaffold abriendo una válvula.

Células Madre Embrionarias (ESC)

• Derivadas de la masa celular interna del blastocisto.
• Divisiones simétricas ilimitadas sin diferenciación (verificado hasta 450 duplicaciones).
• Genoma diploide completo, cariotipo estable.
• Pluripotencialidad: capacidad de formar células de las tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo).
• Capacidad de integrarse en todos los tejidos fetales.
• Capacidad de formar células germinales.
• Clonogénicas: a partir de una célula ES individual, se obtienen colonias idénticas.
• Expresión del factor de transcripción Oct-4 (mantiene el estado proliferativo e indiferenciado).
• Predominantemente en fase S del ciclo celular.
• No inactivación del cromosoma X.

Acondicionamiento en Cultivo

• Cultivo en fibroblastos murinos embrionarios irradiados (mitóticamente inactivos).
• Cultivo en medio seroso (suero o sustitutos) y proteínas morfogenéticas.
• Selección de colonias con morfología indiferenciada.
• Líneas celulares de ES: cultivo con suero o sustituto + bFGF (factor de crecimiento básico de fibroblastos).
• Prueba de pluripotencialidad: inyección subcutánea en ratones (formación de teratoma con células de las tres capas germinales).

Desventajas y Riesgos

• Posibilidad de crecimiento tumoral (teratomas).
• Rechazo inmunológico de células alogénicas.
• Aspectos éticos (uso de embriones humanos).

Células Madre Adultas

• Células no diferenciadas entre células diferenciadas en los tejidos.
• Capacidad de autorrenovación (divisiones simétricas).
• Capacidad de generar múltiples tipos de células diferenciadas.
• Funciones principales:
  1. Mantenimiento y reparación del tejido de origen.
  2. Regulación de otros fenotipos mediante señales bioquímicas.
• Sobreviven en un ambiente específico («nicho de células madre»). Las señales del entorno (matriz extracelular e interacciones celulares) son cruciales.

Ventajas sobre las Células Madre Embrionarias

• Células madre adultas autólogas: no hay problemas éticos ni legales.
• Células madre embrionarias: presentan moléculas extrañas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).
• Células madre adultas autólogas: carecen de moléculas extrañas del MHC, evitando el rechazo inmunológico.
• No hay riesgo de formación de teratoma (menor capacidad proliferativa).

Desventajas

• Menor potencial proliferativo, interfase más larga.
• Desarrollo de linaje restringido (multipotencialidad, como máximo).
• Falta de consenso en su caracterización y propiedades.
• Dificultad para identificar tipos específicos.
• Poblaciones heterogéneas de células.
• Difíciles de encontrar en el tejido.
• Morbilidad del sitio donante.

Extracción de Células Madre Adultas

• Extracción de la cresta ilíaca (cadera) o esternón con anestesia.
• Aguja calibre 16 inyectada hasta la médula ósea.
• Aspiración de tejido medular con aguja heparinizada.
• Los primeros mililitros contienen células hematopoyéticas, adipocitos, progenitores endoteliales y osteoprogenitores.
• Extracción de 2 mL de médula: dilución de células mesenquimales con sangre periférica.

Células Madre Adultas Mesenquimales

Se obtienen a partir de células comprometidas que se diferencian hacia un fenotipo específico. La extracción más común es de la médula ósea mediante centrifugación. Se separan las células mononucleares (parte superior) de los eritrocitos y células polimorfonucleares (parte inferior). Se selecciona la fase mononuclear (monocitos y células mesenquimales). Solo las células mesenquimales madre se adhieren al recipiente de cultivo; el resto se elimina.

Fases de la Experimentación en Ingeniería Tisular

• Primera Fase:
  • Análisis de la respuesta de cada componente por separado.
  • Biocompatibilidad y biodegradación del scaffold, respuesta farmacológica y toxicológica (modelo animal pequeño, subcutáneo).
  • Evaluación de productos de degradación, estudios toxicológicos y carcinogénicos.
  • Evaluación del comportamiento celular in vivo (proliferación y diferenciación).
• Segunda Fase:
  • Análisis de la respuesta in vivo del constructo completo.
  • Animales más grandes que ratones o ratas.
  • Controles bien escogidos, demostrando ventajas y desventajas frente al tratamiento convencional.
• Tercera Fase:
  • Relevancia clínica en situación patológica similar a la humana.
  • Animales grandes.

Técnicas de Fabricación de Scaffolds

Extracción en Frío (Freeze-Extraction)

Se utiliza un solvente que, a baja temperatura, es líquido y disuelve los cristales de solvente generados. Se parte de una disolución homogénea de polímero que se enfría, separándose en dos fases: solvente cristalizado y polímero endurecido. Se sumerge en un baño frío con un solvente líquido que disuelve los cristales, pero no el polímero. Se juega con las familias de buenos y malos solventes del polímero y con la temperatura de solidificación.

Ejemplo con PLLA (ácido poliláctico):

1. Disolver PLLA en dioxano.
2. Enfriar a -20°C (congelador). Se separan las fases (matriz de PLLA y cristales de dioxano).
3. Sumergir en etanol frío (disuelve el dioxano, pero no el PLLA).
4. Al subir la temperatura, el dioxano se elimina, dejando poros.

El tamaño de poro depende del tamaño del cristal (enfriamiento lento = cristales grandes = poros grandes; enfriamiento rápido = cristales pequeños = poros pequeños).

Liofilización (Freeze-Drying)

Procedimiento:

1. Enfriar la disolución de polímero para separar las fases (polímero y solvente).
2. Liofilizar: bajar la presión y evaporar el solvente.
3. El solvente se elimina, dejando poros donde estaban los cristales.

Se puede controlar el crecimiento del cristal con un gradiente de temperatura para obtener poros alineados.

Moldeo por Disolución y Lixiviación de Partículas (Solvent Casting + Particulate Leaching)

1. Preparar un lecho de partículas (compactadas o dispersas).
2. Impregnar con una disolución de polímero (ej., PLLA + partículas).
3. Evaporar el solvente (solvent casting). El PLLA se solidifica rellenando los huecos.
4. Disolver las partículas, dejando huecos (poros).

Es difícil obtener una buena conexión entre poros.

Polimerización con Plantilla (Template Polymerization)

Se utiliza un lecho de partículas (plantilla o template) como porógeno. Las partículas (ej., esferas de sal o azúcar) se compactan para formar conexiones poro-poro. Se utilizan solventes no tóxicos.

Lecho de Partículas

Procedimiento:

1. Preparación del template (esferas).
2. Sinterización (presión y temperatura) para unir las esferas.
3. Rellenar los huecos con:
   • Monómero líquido, polimerizar y eliminar el template.
   • Disolución polimérica, evaporar el solvente y eliminar el template.
   • Granza fundida (aplicar temperatura y presión).
4. Extraer el porógeno con un solvente selectivo.

Fibras Textiles

Se utilizan telas formadas por fibras (ej., ortogonales, apiladas) como template. Se requiere compactación para unir las capas.

Procedimiento:

1. Compactar las capas.
2. Rellenar los huecos con monómero, disolución polimérica o granza fundida.
3. Eliminar las fibras con un solvente, dejando el polímero.

La estructura resultante depende de la organización de las fibras (ej., conductos en direcciones x e y).

Hilos Cilíndricos Paralelos

Se utilizan hilos como template. Se colocan en un molde tubular, se estiran y se rellenan los huecos. No se requiere compactación. Se obtiene una estructura de poros acanalados (útil para regeneración neural o de dentina).

Congelación y Lixiviación (Freeze + Leaching)

Se congela rápidamente para evitar que el solvente disuelva las partículas porógenas.

1. Mezclar el porógeno (esferas) con la disolución de polímero.
2. Congelar rápidamente (nitrógeno líquido o congelador). El solvente y el polímero cristalizan.
3. Extraer el solvente en frío con un solvente líquido (ej., etanol) que no disuelva el polímero.
4. Si es difícil encontrar un solvente adecuado, se puede entrecruzar el polímero.

Se puede regular el tamaño del macroporo (esferas) y del microporo (pared del scaffold, generado por la separación de fases del polímero y el solvente). La proporción de solvente y esfera, y la cantidad de solvente, controlan la porosidad y las propiedades mecánicas.