Síntesis de ADN in vitro

Se estudió el mecanismo de cómo a partir de una hebra de ADN se sintetizaba otra hebra nueva complementaria, y qué enzima regulaba ese proceso.

Se aisló de la bacteria Escherichia coli una enzima, la ADN-polimerasa.

Para actuar, la ADN-polimerasa necesita desoxirribonucleótidos, iones magnesio y un ADN en el que se ha retirado un sector de una de las dos cadenas. La cadena entera será tomada como patrón, el extremo 3’ de la otra cadena será utilizado como cebador.

La ADN-polimerasa está constituida por unos mil aminoácidos que se encuentran en el núcleo y en las mitocondrias. Permite la síntesis in vitro de ADN a partir de otro ADN; sin embargo, esta enzima es incapaz de crear un ADN de novo, solo se limita a añadir nucleótidos al cebador.

La cadena de ADN solo puede crecer en sentido 5’-> 3’.

La ADN-polimerasa actúa de tal manera que el nuevo ADN sintetizado es antiparalelo y complementario al filamento patrón.

Síntesis de ADN in vivo

La técnica para sintetizar ADN in vivo consiste en extraer muestras de ADN bacteriano marcado con tritio y depositarlas sobre una placa sensible para obtener una autorradiografía de la molécula.

En las imágenes de los resultados, las primeras tenían forma de V y las posteriores con forma de O.

• Las de forma de V corresponden a las horquillas de replicación, formadas por las dos nuevas hebras de ADN tritiado sintetizadas sobre la doble cadena antigua cuyos filamentos habían servido de molde.
• Las formas O constituyen las burbujas de replicación.

Los resultados confirmaron la hipótesis semiconservativa y evidenciaron un punto de inicio en la replicación.

Se plantearon nuevas incógnitas: cómo las dos hebras de la horquilla podían crecer en paralelo, y cómo la ADN-polimerasa podía sintetizar sin necesidad de cebador.

La explicación: se descubrieron unos fragmentos constituidos por cincuenta nucleótidos de ARN y unos mil de ADN y se denominaron fragmentos de Okazaki. Estos filamentos son iniciados por la ARN-polimerasa y terminados por la ADN-polimerasa en dirección 5’-> 3’ sobre diferentes regiones de la hebra patrón. Después pierden su porción de ARN y son rellenados con ADN, constituyendo un filamento de ADN que aparentemente crece en dirección 3’->5’.

Duplicación de ADN en procariotas

• Fase de iniciación: Hay una secuencia de nucleótidos denominada origen de replicación, que actúa como señal de iniciación de todo el proceso de duplicación. Este proceso se inicia con una enzima llamada helicasa que separa las dos hebras rompiendo los puentes de hidrógeno que las une. Las topoisomerasas eliminan tensiones de las hebras. Las proteínas estabilizadoras mantienen la separación de las dos hebras complementarias y se inicia la formación de las horquillas de replicación. Las dos horquillas de replicación enfrentadas forman la burbuja de replicación.
• Fase de elongación: además de las enzimas anteriores intervienen las ARN-polimerasas y las ADN-polimerasas. Una ARN-polimerasa denominada primasa sintetiza un fragmento de ARN formado por unos diez nucleótidos, denominado primer. Una ADN-polimerasa, partiendo del primer, comienza a sintetizar una hebra de ADN. Esta hebra tiene un crecimiento continuo y se llama hebra conductora. Sobre la otra hebra, la retardada, que es antiparalela a la anterior, la ARN-polimerasa sintetiza nucleótidos de ARN y se forma un fragmento de Okazaki. Posteriormente interviene otra ADN-polimerasa que retira los segmentos de ARN y los rellena por ADN.

Duplicación del ADN en células eucariotas

Similar a las procariotas pero con algunas diferencias:

• El ADN está asociado a histonas, formando nucleosomas. En la replicación, la hebra que sirve de patrón a la conductora se queda con las histonas y se enrollan juntos sobre los octámeros antiguos, en forma de collar de perlas.
• La longitud de ADN de un cromosoma eucariótico es mucho mayor que la del ADN bacteriano, y el proceso es más lento, seguramente por la presencia de histonas.
• En el ADN de un cromosoma no hay solo un origen de replicación, sino aproximadamente un centenar. Se forman unas cien burbujas de replicación.
• Los fragmentos de Okazaki son más pequeños.

Expresión del lenguaje genético

En el mecanismo por el cual se pasa de una secuencia de nucleótidos de ADN a una secuencia de aminoácidos de una proteína, se diferencian dos procesos:

• Transcripción: se lleva a cabo donde está el ADN celular o genoma. A partir de la secuencia de aminoácidos de un gen (ADN) se realiza una copia con la secuencia de nucleótidos complementarios correspondientes a un ARNm.
• Traducción: Se realiza en los ribosomas y se obtiene una secuencia de aminoácidos a partir de la secuencia de ribonucleótidos del ARNm obtenido en la transcripción.

Este flujo fue propuesto como el dogma central de la biología molecular; sin embargo, no lo siguen los virus con ARN en lugar de ADN.

Traducción y biosíntesis de proteínas

La traducción es la síntesis de la secuencia de aminoácidos de una proteína siguiendo el mensaje del ARNm. Tiene lugar en los ribosomas y en ella intervienen:

• ARN mensajero,
• ARN ribosómico,
• ARN transferente,

y se distinguen 3 etapas:

• activación,
• traducción,
• asociación.

El Operón

Es lo que controla la síntesis de ARNm y se descubrió a partir del efecto glucosa.

Si se cultiva Escherichia coli en un medio con lactosa y se le añade glucosa, el nivel de la enzima B-galactosidasa disminuye.

Esta enzima cataliza la reacción de disociación de la lactosa en glucosa y galactosa, no necesaria si hay glucosa en el medio. Las enzimas aparecen solo cuando son necesarias y después se degradan.

Se propuso un modelo denominado Operón para explicar el control de la biosíntesis proteica; se diferencian en él dos tipos de genes: estructurales y reguladores. Los primeros codifican para proteínas enzimáticas; y los segundos codifican para proteínas. Hay dos tipos de operones: el operón lactosa y el operón histidina.