Cromatografía Técnica para separar un compuesto de una mezcla, sirve para identificarlos y cuantificarlos. La fase móvil atraviesa la estacionaria y se van reteniendo.

Clasificación Cromatográfica

Naturaleza de las FASES

1. Estacionaria

-D Líquido Cromatografía de reparto las Sólidas Croma de adsorción, Croma de intercambio iónico Reacción quím. ruptura y forma enlaces; Croma de exclusión molecular. Tamiz molecular, Cro afinidad Reacción antígeno/anticuerpo.

2. Móvil

D Gas, líquido o fluido super-crítico Polaridad de las fases; 1. Normal -D cuando f. móvil es polar F. Polaridad fases Estacionaria + Polar GC. 2 Inversa F. Móvil + POLAR HPLC, Desarrollo del proceso Frontal la muestra se introduce de forma continua. Ella es f. Móvil desplazamiento la f. móvil tiene 1 componente afín f. estacionaria desplaza a los componentes Elución la f. móvil circula continuamente en 1 momento determinado se introduce la muestra.

Geometría de las fases

Columna La f. estacionaria se sitúa en tubo; Plano la f. estacionaria en una superficie abierta (papel o capa fina).

Objetivo a alcanzar

Preparativa obtención componentes puros; Analítica cuantitativo y cualitativo. * Croma en papel/capa fina PC papel usado TLC capa fina (se fija a una placa metal Ventajas TLC vs PC 1. + rápida +Versátil +reproducible. Manchas definidas se usan reveladores enérgicos cuantitativo + fiable Aplicación Visualizar el nº d componentes de la mezcla Semi cuantitativo Identificas sustancias – por RF Cualitativo. *Croma en columna 1ºEluyente 2ºSilica gel,3ºmuestra 4º eluyente , Se recogen los eluyentes (son de distinto color) sust. a separar.*Cro de adsorción F. estacionaria sólido polar adsorbente. F. móvil gas o líquido . dando lugar a Gas-sólido y líquido-solid Cuanto más polar sea sustancia de la muestra más va a ser retenida por la f. estacionaria.

Cro de exclusión molecular Tamiz molecular o permeación en gel, F. estacionaria esferas de geles hinchables, F. móvil eluyente, Separa en función de tamaños moleculares, Cro de afinidad estacionaria grupo funcional ligado por enlaces covalentes, a una sola especie. Reconoce el analito Componentes se quedan en la columna intercambio Ioni Genera y rompe enlaces iónicos. HPLC Croma de líquidos Es de fase inversa /Fase móvil + polar Proceso isotérmico mantiene temperatura Fase estacionaria es apolar son Fases monoméricas oligoméricas y poliméricas. Electroforesis y Electrofotometría adsorción.

Elución Isocrítica fase móvil es constante durante la separación. Bombas caudal y P constante. Extracción de la sustancia adsorbida Gradiente Se varía el poder de la fase móvil cambiando en composición Partes del equipo HPLC Bomba de alta Presión T y caudal; Inyector donde cargas; Columna hace separación; Detector monitoriza la separación UV; Celda de flujo detectores por donde pasa la luz; Horno columna; Software de control y recogida datos; Análisis Reservorio de solventes de f. móvil; Sist. Desgasificación y Control; T Electroforesis El analito se carga eléctricamente Migración diferencial (en sentido y velocidad) de partículas cargadas en campo eléctrico. Electro fotometría Técnica de adsorción excitación La energía absorbida por la molécula en forma UV es utilizada para moverse cuando deja de moverse, percibimos color. Blanco refleja todas radiaciones, Negro absorbe todas longitudes de onda Color absorbe una parte. LEY DE LAMBERT-BEER A = ε . b. C relaciona luz con la concentración, ε Absorbancia, b Longitud de paso de la cubeta, C – concentración de la disolución, A -Absorbancia = – Log T – La Luz q se retiene Absorbancia T Transmitancia intensidad de luz inicial (q llega) entre la que sale – Coges patrones mides.

Absorbancia, representamos. concentración. Dispersión de las radiaciones que absorben. Técnicas dispersivas: Turbidimetría y Nefelometría desviación de la luz al atravesar la muestra Se mide la luz dispersada; Difracción RX, investigación cristales; TAC Resonancia magnética Nuclear. Espectrofotometría de masas Ionizas la masa, ultra centrifugación, velocidad equilibrio y gradient ;transferencia, Fluorescencia y radioactividad. Monosacárido q contiene un grupo aldehído es una Aldosa. Se nombran polihidroxialdehído/oxicetona según el número de átomos de carbono que poseen b) Por su grupo funcional. Enlace q se forma durante la ciclación de pentosas y hexosas grupo carbonilo reacciona con el grupo hidroxilo en el C más alejado? b) Enlace hemiacetal. Molécula q se forma asociada mediante enlaces glucosídicos? Oligosacáridos. Asociación de un gran número de monosacáridos con enlaces glucosídicos? Polisacáridos. Propiedad de los lípidos? Solubles en disolventes orgánicos. Característica principal de la parte polar de los Ácidos Grasos? Grupo carboxilo. Región apolar de los fosfoglicéridos es la Cadena de ácidos grasos. Función principal de estructuras bicapa de fosfolípidos en las membranas celulares? Regulación paso de sustancias. Estructura característica en los esteroides? Ciclopentano. Secuencia para la formación de nucleótidos a partir de las bases nitrogenadas y azúcar pentósido? Base nitrogenada + Azúcar → Nucleósido. Componente q agrega al nucleósido para formar el nucleótido c) Grupo fosfato. Diferencia principal en el azúcar presente en (ARN) y (ADN)? La desoxirribosa tiene un grupo hidroxilo adicional en la posición 2′. Agente extractor en la etapa de lisis para inhibir la actividad de las ARNasas? Tiocianato de guanidina. Los ácidos nucleicos se unen a bolas paramagnéticas en presencia de sales caotrópicas. Los detergentes Desnaturalización de las proteínas.

Base de la formación del complejo coloreado en el método Biuret es el Complejo entre Cu2+ y los N de los enlaces peptídicos. Cuantificación de proteínas en suero y otros preparados muy concentrados. Método de Bradford Unión directa del colorante azul de Coomassie a la estructura terciaria de las proteínas. Método BCA Simplicidad, rapidez, alta sensibilidad y tolerancia a compuestos interferentes. Turbidimetría se mide la Absorbancia. Northern Blot No se requiere digestión enzimática previa con enzimas de restricción. Fase estacionaria columna Gel de sílice, tierra de infusorios y gel de almidón o celulosa. Elución isocrítica La fase móvil tiene un poder eluyente constante durante la separación. Análisis fotométricos Medición de la luz que absorbe un líquido o disolución. TLC VS PC • Más rápida. • Más versátil. • Más reproducible. • Con manchas más definidas y menos difusas más clara si se utiliza la cromatografía triangular. Cromatografía en fase normal: la fase móvil es menos polar que la estacionaria, como en GC. En fase inversa: la fase móvil es más polar que la estacionaria, como en HPLC. Cromatografía de afinidad o bioselectiva la fase estacionaria contiene grupo funcional por enlace covalente a una especie la mezcla se une a la columna y se eluye el resto, es muy selectiva aplicable a bioquímica extrae enzimas substratos antígenos anticuerpos hormona receptores, inconvenientes se tarda en preparar la columna, ventaja rendimiento excepcional.