Espacios y Equipamiento en el Laboratorio de Histotecnología y Citología

Espacios de Laboratorio

• Áreas de estudio macroscópico, microscopía, citología, histología, inmunohistoquímica, tinción y montaje.

Espacios Relacionados con el Laboratorio

• Almacén de productos.
• Recepción de muestras.
• Archivos.
• Área de autotécnicas.
• Secretaría.
• Despacho de patólogos.
• Sala de autopsias y sesiones clínicas.

Equipamiento

• Jefe de servicio.
• Infraestructuras:
  • Espacio físico y aparataje.
  • Productos químicos y material fungible.

Tareas Técnicas en el Laboratorio

• Fijación de las biopsias.
• Realización de reactivos y control del almacenamiento.
• Inclusión en parafina.
• Confección de bloques y mantenimiento.
• Corte de los bloques.
• Realización de las coloraciones.
• Lavado del material.
• Archivo y control de bloques y preparaciones.
• Almacenamiento y control de los suministros.

Fundamentos de Histotecnología

La histotecnología es la ciencia que estudia los fundamentos técnicos y la secuencia de manipulaciones necesarias para llevar a cabo el análisis de los tejidos de los seres vivos.

Impronta: Capa unicelular dispuesta sobre un portaobjetos por contacto directo de este con la superficie de sección de un órgano.

Material de Laboratorio

• Vidrio: Vasos de precipitado, matraces, tubos de ensayo, varillas de agitación, portaobjetos con banda mate, cubreobjetos, pipetas Pasteur.
• Material fungible: Desechable, reutilizable (tubos de ensayo, pipetas).
• Material inventariable.
• Instrumental: Baños de flotación, estufas, centrífugas (para la concentración de células y separación de fases), balanzas, neveras y congeladores, autoclave (para esterilizar por calor húmedo), agitadores, agua.

Tipos de Muestras en Citología

• Fluidos: Orina y esputos.
• Líquidos: Pleural, ascítico, LCR, pericárdico.
• Lavados: Peritoneal, contenido quístico, vesical.
• Exudado: Nasal, secreción de pezón.
• Otros: Tejido, piel, uñas.

Petición de Pruebas

• Volante abierto o en blanco: Se usa en medicina privada. Espacio para solicitar prueba en blanco. Se solicita cualquier prueba a cualquier laboratorio.
• Volante preestablecido: Las pruebas están impresas aisladas o en forma de perfiles.

Fijadores: Tipos y Características

Formol

Composición química: Formaldehído (componente tóxico y volátil). Se emplea en todo tipo de tejidos con un grosor de 0.05 cm. Es un buen fijador para cerebros enteros.

Inconvenientes: Se oxida en solución acuosa y da lugar al ácido fórmico que se deposita en la pieza y da lugar a unos precipitados negruzcos.

B-5 (Lugol y Diosulfato)

Composición: Fijador mercurial compuesto por una sal de mercurio en una solución tamponada y formol.

Empleo: Estudio de microscopía óptica. Como característica esencial, preserva las células, principalmente para tejido linfático. Las piezas tienen que tener un grosor de 2 mm a 3 mm.

Inconvenientes: Los precipitados que produce el mercurio en el tejido son de color marrón. Es muy caro y la fijación ha de ser controlada.

Características de un Fijador Ideal

• Capacidad para bloquear la autolisis inmediatamente.
• Poseer efecto microbicida, impidiendo la acción bacteriana, la cual provoca la degradación del tejido.
• No provocar retracciones o distorsiones que determinen alteraciones en su estructura.
• Inducción en la textura y composición tisular que favorezcan la inclusión, el corte o la coloración del material histológico.

Tipos de Fijadores

• Fijadores por métodos físicos: Congelación.
• Fijadores por métodos químicos: Actúan desnaturalizando las proteínas e insolubilizándolas.

Líquidos Fijadores Simples por Métodos Químicos

• Deshidratación tisular: Alcohol etílico (90º), absoluto (puro), isopropílico (70º), acetona.
• Por cambio en el estado coloidal de las proteínas: Ácido acético, ácido tricloroacético, ácido crómico.
• Formación de sales en el tejido: Cloruro mercúrico o sublimado, dicromato potásico, ácido pícrico.
• Formaldehído.
• Otros: Glutaraldehído, tetraóxido de osmio.

Mezclas Fijadoras que Contienen Formol

• Líquido de Bouin: Se utiliza para piel, órganos endocrinos, testículos y tejidos embrionarios. NO para riñón.
• Líquido de Bouin-Mollander: Fija cilindros de médula ósea cuando no es posible controlar el tiempo de fijación.
• Bouin alcohólico: Ideal para glucógeno.
• Líquido de Gendre: Glucógeno y pigmentos derivados de la hemoglobina.
• Fijador de Orth: Demostrar la reacción cromafín o en ciertas técnicas de impregnación argéntica para tejido nervioso.
• B5 y Zenker formol: Riñón, tejido conectivo, fibrina e hígado.

Mezclas Fijadoras que NO Contienen Formol

• Líquido de Zenker: Descalcifica biopsias de médula ósea.
• Líquido de Carnoy: Fijador de glucógeno, hidratos de carbono, proteínas fibrilares y microfibrillas.
• Metanol-Carnoy: Evita el endurecimiento y retracción tisular.

Procedimientos Especiales

Desenkerización

Procedimiento para eliminar el pigmento mercúrico. Se someten a este tratamiento los cortes fijados en soluciones con cloruro mercúrico. Se realiza tratando los cortes antes de la coloración con soluciones yodadas.

Eliminación del Pigmento Formólico

El pigmento formólico es un precipitado pardo negruzco que se origina por la reacción del ácido fórmico con la hemoglobina y los pigmentos derivados de ella. Para evitarlo, el formol debe guardarse en frascos opacos o emplearse en solución neutra o tamponada. Para eliminarlo de los tejidos se tratan los cortes con una solución alcohólica de ácido pícrico.

Descalcificación y Reblandecimiento

Los tejidos que contienen elementos duros no se pueden cortar, se deben eliminar las sales de carbonato cálcico y el fosfato de los depósitos calcáreos. Se descalcifican con un ácido carbónico.

Inclusión: Métodos y Técnicas

El método más común para la inclusión es la parafina.

El proceso de inclusión comprende: deshidratación, aclaramiento e inclusión.

• Deshidratación: Tiene por finalidad eliminar el agua de los tejidos. El agente deshidratante no debe alterar las estructuras tisulares y debe ser miscible con el agente intermedio. El agente deshidratante más común es el alcohol etílico. El volumen de deshidratante debe de ser 10 veces el de la muestra.
• Aclaramiento o desalcoholización: El agente aclarante es un intermediario entre el agente deshidratante y el agente de inclusión, por lo que debe de ser miscible en ambos. El aclaramiento consiste en sustituir el agente deshidratante por otro que sea miscible con el agente de inclusión y que permita la penetración de este en el tejido. El proceso incluye baños sucesivos. Entre los agentes aclarantes más comunes está el xilol.
• Inclusión: Tiene como objetivo rellenar la muestra con el agente de inclusión ocupando los espacios que estaban ocupados por agua. La finalidad es proporcionar a la pieza homogeneidad y dureza para obtener secciones.

Componentes de un Microtomo

• Portabloques: En él se apoya el material de corte que avanza sobre la cuchilla. Lleva un sistema que garantiza su paralelismo con la cuchilla.
• Portacuchillas: Consiste en un mecanismo de fijación basado en una pieza orientada especialmente. Esta pieza permite variar el ángulo de inclinación de la cuchilla, así como su grado de incisión al portador.
• Mecanismo de avance del portabloques sobre la cuchilla: Sistema mecánico o electrónico que proporciona cortes sucesivos de tejidos a partir del bloque. Se permiten cortes de hasta una micra.

Tipos de Microtomos

• De oscilación o balanceo: Las secciones se obtienen por un sistema oscilatorio de palanca.
• De rotación o Minot: Más usado. Portabloques en posición vertical. Muy caro y muy complicado.
• Microtomo de deslizamiento: Existen dos tipos según se deslice el portabloques sobre la cuchilla (Leitz) y según se deslice la cuchilla sobre el portabloques (Reichert-Jung). Barato pero lento.
• Criostato: No usa el medio de inclusión. Es el más usado para intraoperatoria.
• Microtomo de congelación: Se realiza para cortes de tejido congelado y no deshidratado.
• Ultramicrotomo: La cuchilla está fija mientras que el portabloques es móvil. Permite obtener cortes muy pequeños (0.01 micras). Hay dos tipos: Porter-Blum (avance mecánico) y LKB (Reichert) debido a la dilatación de la barra maciza unida.

Técnicas de Corte sobre Bloques de Parafina

• Retallado de los bloques de parafina.
• Enfriado del bloque (entre 5 y 10 grados, placa de frío 4).
• Fijación del portabloques dentro del microtomo.
• Orientación del bloque.
• Orientación de la cuchilla del microtomo (25-30 grados).
• Selección del espesor del corte (desbastar a 20 micras, cortar a 3 micras).
• Realización de las secciones (temperatura cambiante).

Procesamiento de Tejidos Parafinados

Quitar la parafina e hidratar. Para desparafinar se someten a calor para derretir la parafina y se ponen en baños de xilol. Para eliminar este se moja en alcoholes decrecientes hasta el agua destilada.

Hematoxilina-Eosina (H&E)

Técnica por excelencia. La hematoxilina es un colorante básico, tiene apetencia por el ADN del núcleo (colorante nuclear) y la eosina es un colorante catiónico aniónico que tiñe el citoplasma de las células en rosa.

Una vez teñidos, se vuelven a deshidratar los cortes mojándolos sucesivamente en alcoholes y se aclara en baños de xilol.

Colorantes: Definición y Tipos

Colorante: Sustancia que puesta en contacto con un soporte adecuado se une a él de forma perdurable dándole su color.

La coloración se basa en la afinidad particular de ciertos tejidos celulares por una sustancia colorante.

Tipos de Colorantes

• Naturales: Hematoxilina, Carmín y Orceína.
• Artificiales.

Formas de Teñir

• Técnicas de inmersión: Sumergir en cada cazoleta de la batería de tinción.
• Técnicas de vertido: Verter el colorante sobre la preparación.

Naturaleza Química de los Colorantes

• Básicos: Colorean estructuras ácidas (Hematoxilina).
• Ácidos: Tiñen estructuras básicas (Eosina).
• Neutros: Propiedad de colorear conjunta y separadamente, adquieren tonalidad polícroma (Tinción de Giemsa).
• Indiferentes: Colorean tejidos a través de mecanismo de impregnación física.

Clases de Coloración

• Topográficas: Visión de conjunto de las estructuras de un tejido (Hematoxilina).
• Citologicas: Estudio íntimo de las estructuras celulares (Papanicolaou).
• Estructurales: Ponen en evidencia los componentes íntimos de ciertas estructuras tisulares.
• Ultraestructurales: Ponen en evidencia las estructuras de microscopía electrónica.

Coloraciones Nucleares

• Coloración del rojo neutro (rojo).
• Lacas de hematoxilina.
• Carmín (rojo púrpura).
• Fucsina.
• Safranina.
• Galocianina y azul celestina B.
• Rojo nuclear.

Colorantes Citoplasmáticos

Permiten el estudio de los núcleos. Los colorantes más utilizados son: Fucsina, naranja G, fucsina ácida y eritrosina.

Características: Tinte difuso, empastan poco, uso cómodo y permiten el estudio de estructuras citoplasmáticas.

Colorantes de Conjunto

Hematoxilina-eosina: La hematoxilina colorea estructuras ácidas de azul púrpura y la eosina las estructuras básicas de rosa.

Técnicas Argénticas

• Permanganato potásico: Favorece la coloración.
• Ácido oxálico o metodisulfito sódico: Blanquea.
• Sulfito de hierro y amonio: Mordiente.
• Solución de Wildev: Sal metálica o solución de plata.
• Formol al 10%: Agente reductor.
• Cloruro de oro: Modifica el color final.
• Tiosulfato sódico: Fija la coloración.

Se llama impregnación a toda coloración especial en la que se usan sales metálicas para originar precipitados metálicos sobre las estructuras que se van a demostrar. La sal argéntica más usada es el nitrato de plata, muy soluble en agua. La sal metálica se convierte en plata metálica por la acción de una sustancia reductora, se pasa por cloruro de oro para modificar el color final y eliminar precipitados, se pasa por ácido oxálico para blanquear y para fijar la coloración se usa tiosulfato sódico.

En las técnicas de plata se debe cuidar la limpieza del material para que no precipite, ha de lavarse con lejía, se aclara con agua destilada y se seca en estufa a 60º C. No se deben utilizar objetos metálicos.

Argirofilia

Propiedad que tienen los tejidos de atrapar los iones argénticos.

Estructuras Argirófilas

Tienen afinidad con las sales de plata.

Impregnación Argéntica en un Tiempo

Técnica de Bodian para neurofibrillas y la de Grimelius para argerofilia.

Impregnación Argéntica en Dos Tiempos

El más común es la impregnación para fibras de reticulina de Gomori y Gordon-Sweet.

Impregnación Argéntica por Mecanismos Histoquímicos

Técnica de Masson-Fontana.

Técnicas Argénticas más Habituales

• Wilder o reticulina: Resultados: Fibras de reticulina en negro.
• Soluciones de plata metanamina: Resultados: Fibras de reticulina y hongos en negro sobre fondo verde.