Tecnologías de ADN Recombinante

Las tecnologías de ADN recombinante son técnicas de estudio y manipulación del ADN, conocidas como ingeniería genética.

1. Desnaturalización/Fusión del ADN

El ADN se desenrolla a una temperatura alta o con un pH mayor que 13. Este proceso es más fácil cuanto más corto sea el ADN o cuanto más rico sea en adenina y timina, ya que estas bases están unidas por solo dos puentes de hidrógeno. Las hebras se separan, un proceso muy importante para el estudio y la manipulación del ADN.

Es un proceso reversible: la desnaturalización permite acceder a las hebras separadas y comparar el ADN, mientras que la renaturalización, que se produce cuando el ADN se enfría, permite que las hebras vuelvan a asociarse. La información para este proceso está en las secuencias.

2. Hibridación

Si dos ADN de distinta procedencia están desnaturalizados y sus cadenas son complementarias, tienden a unirse formando híbridos. Esta técnica se utiliza para comparar el ADN y se produce mediante la desnaturalización y la mezcla de ADN de distintas procedencias. A mayor hibridación, más parecidas serán las secuencias. Se puede hacer el mismo proceso con ADN y con ARN.

3. Enzimas de Restricción

Son endonucleasas que se descubrieron en bacterias, como la EcoRI, cuya función es cortar el ADN en secuencias específicas. Este es un mecanismo de protección contra los virus.

El corte se produce en escalón, lo que es muy útil porque se sabe dónde va a cortar la enzima. Cuando se cortan las secuencias, estas son complementarias y se pueden ligar, formando ADN recombinante. También pueden ligarse con una molécula distinta o consigo mismas mediante la ADN ligasa.

4. PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Esta técnica se utiliza para amplificar o clonar ADN, produciendo muchas copias de forma fácil y rápida. Siempre se trabaja con trozos cortos de ADN in vitro. Su gran velocidad la hace muy útil para el estudio de los genes.

El proceso se produce mediante el corte del ADN con enzimas de restricción, lo que permite saber dónde se va a cortar. Más tarde, hay que separar las hebras para poder copiarlas. Para esto no sirve la desnaturalización normal porque a altas temperaturas las enzimas también se desnaturalizan.

Para solucionar este problema, el proceso se basa en bacterias extremófilas (termófilas: viven a altas temperaturas), utilizando las enzimas de estas bacterias. Se añaden cebadores rápidamente cuando las hebras se separan, junto con una ADN polimerasa y los precursores trifosfato. De esta forma, se replica el ADN en dirección 5′ a 3′.

Este proceso se repite sucesivamente, produciendo un crecimiento exponencial del número de hebras. A mayor temperatura, hay que poner más cebadores y, por lo tanto, añadir más nucleótidos. Es un proceso rápido que se usa, por ejemplo, en ciencia forense.

Para la huella genética se utilizan secuencias de ADN que no tienen genes, ya que son muy variadas y presentan muchas mutaciones.

Usos de la PCR:

• ADN de células embrionarias: diagnóstico prenatal rápido, detección de trastornos.
• ADN antiguo: amplificación de ADN de especies extinguidas, momias.
• ADN de genes virales: detección de células infectadas con virus difíciles de detectar.

5. Secuenciación

Tanto la secuenciación como la PCR son sistemas simplificados en comparación con la replicación in vivo. En este proceso se establecen las secuencias, la información está en la secuencia de bases, en el orden en el que están dispuestas.

El método más utilizado es el ddNTPs:

En este método se utilizan ADN monocatenarios de una sola hebra. Para que se establezca la hebra complementaria, hay que añadir nucleótidos. Uno de ellos está modificado de forma que es fluorescente en el extremo 3′, ya que se le ha añadido una molécula fluorescente.

Esto conlleva que, además de la fluorescencia, el tener el extremo 3′ bloqueado hace que la creación de la nueva hebra se detenga. Se van creando trozos más cortos que acaban en una base fluorescente y estos fragmentos se ponen en un tubo que contiene un gel de electroforesis.

Los fragmentos más cortos viajan más rápido y los más largos más lento en el gel, por lo que se van a separar. Un láser UV y un detector de color leen la secuencia de colores. El tubo se va moviendo por el láser y, cuando este detecta cada color, va estableciendo la secuencia de bases, ya que cada base tiene una fluorescencia de diferente color que indica el nucleótido final.

Estas bases se van empalmando después de un gran estudio y pruebas hasta que se obtiene un resultado coherente en forma de espectrograma.

6. ADN Recombinante

El ADN recombinante se utiliza para expresar un gen, una secuencia de ADN, en otro individuo. Lo primero que hay que hacer es identificar la secuencia, cortarla e introducirla en el otro individuo. Para ello, existen una serie de mecanismos:

Se utilizan vectores genéticos. El proceso consiste en insertar unos genes marcadores en el plásmido utilizado como vector. Después, se aíslan el ADN humano y el plásmido, y se cortan con la misma enzima de restricción. El ADN humano se rompe en muchos fragmentos y el plásmido en un solo sitio.

Posteriormente, se mezclan los fragmentos de ADN humano con los plásmidos cortados, insertando el ADN humano en algunos de los plásmidos. Con la ADN ligasa, el plásmido se cierra. Por último, se introducen los plásmidos en las bacterias.

Estas bacterias son transgénicamente alteradas, es decir, son transgénicas.

Para saber si se ha producido ADN recombinante se pueden utilizar:

1. Marcadores visuales: fluorescentes, en animales, plantas…
2. Bacterias: se les introducen antibióticos a la vez que se hace el proceso para obtener el ADN recombinante. Solo sobrevivirán las bacterias que hayan incorporado el ADN recombinante.
3. Sondas: son pequeños oligonucleótidos de cadena sencilla que se hibridarán con cualquier ADN recombinante que tenga una secuencia de bases complementaria. Se pueden obtener sistemáticamente cuando se conoce una parte de la secuencia de bases del gen de interés o bien la secuencia de aminoácidos de la proteína que codifica. Para poder rastrearla, se marca la sonda radiactivamente o con una molécula fluorescente.

7. Usos de los Individuos Transgénicos

1. Investigación
2. Uso comercial:
   • Medicina: producción de fármacos como la insulina. Antes se obtenía del páncreas de cadáveres y de cerdos, y ahora se realiza introduciendo un vector con el gen humano que produce insulina en una bacteria, que la produce y no la utiliza. También se hace en levaduras, que tienen una maquinaria celular más parecida a la nuestra para la maduración del ARNm.
   • Agricultura:
     • Resistencia a herbicidas: por ejemplo, la soja transgénica es resistente al glifosato.
     • Mayor rendimiento y menor uso de insecticidas.
     • Mejora del producto: mayor valor nutritivo.
     • Plantas farmacéuticas: producción de sustancias.
   • Ganadería: los animales se desarrollan más rápido y producen una mayor cantidad de productos.