Aislamiento y Purificación de Proteínas

El aislamiento y purificación de proteínas son procesos cruciales en bioquímica y biología molecular. A continuación, se describen las técnicas más comunes:

• Precipitación salina: Es un método de separación de proteínas basado en su solubilidad diferencial. Cada proteína tiene una solubilidad distinta, siendo menos soluble al aumentar la fuerza iónica del medio. Este método permite una purificación inicial de proteínas, donde algunas se disolverán y otras precipitarán.
• Diálisis: Se basa en la difusión selectiva de moléculas a través de una membrana semipermeable. Esta membrana permite el paso de moléculas pequeñas (sales, tampones), pero retiene las moléculas grandes (proteínas). Se utiliza un saco dializador (comúnmente de celofán) con poros ultramicroscópicos. Este método es útil para eliminar sales o cambiar el tampón de una muestra de proteínas.
• Filtración en gel (Cromatografía de exclusión molecular): Esta técnica separa moléculas en función de su tamaño y forma. Se utiliza una columna rellena con un gel poroso. Las moléculas más grandes eluyen primero, ya que no pueden entrar en los poros del gel, mientras que las moléculas más pequeñas se retrasan al entrar y salir de los poros. Se obtienen fracciones que contienen proteínas de diferentes tamaños.
• Electroforesis: Separa moléculas cargadas en un campo eléctrico. Las proteínas se separan en función de su carga y tamaño. Se utiliza un gel (comúnmente de poliacrilamida) como soporte. Las proteínas migran hacia el electrodo de carga opuesta. Después de la electroforesis, las proteínas se visualizan mediante tinción (por ejemplo, con azul de Coomassie). Se utilizan patrones de peso molecular conocido para estimar el tamaño de las proteínas separadas.

Secuenciación de Proteínas: Técnica de Sanger

La técnica de Sanger permite determinar la secuencia de aminoácidos de una proteína purificada. Este método se basa en la reacción del fenilisotiocianato con el grupo amino terminal de la proteína. A continuación, se detallan los pasos:

1. El fenilisotiocianato reacciona con el grupo amino del aminoácido N-terminal de la proteína a pH 9, formando un derivado feniltiocarbamil (PTC).
2. La adición de ácido trifluoroacético (F₃C-COOH) rompe el enlace peptídico entre el primer y el segundo aminoácido, liberando el aminoácido N-terminal en forma de un derivado de tiazolinona.
3. Este derivado se convierte en una feniltiohidantoína (PTH), que es más estable y se puede identificar mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
4. Se compara el tiempo de retención del derivado PTH con patrones de PTH-aminoácidos conocidos para identificar el aminoácido N-terminal.
5. Este ciclo se repite para cada aminoácido de la proteína, determinando así la secuencia completa desde el extremo N-terminal.

Desnaturalización de Proteínas

La desnaturalización de una proteína implica la pérdida de su estructura tridimensional nativa (y, por lo tanto, de su función). Los factores que pueden causar la desnaturalización incluyen:

• Cambios de pH: La variación del pH puede alterar las cargas de las cadenas laterales de los aminoácidos, afectando las interacciones electrostáticas y los puentes de hidrógeno que estabilizan la estructura de la proteína.
• Calentamiento: El aumento de la temperatura incrementa la energía cinética de las moléculas, lo que puede romper las interacciones débiles (como los puentes de hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas) que mantienen la estructura terciaria y cuaternaria de la proteína. Generalmente, las proteínas comienzan a desnaturalizarse por encima de los 40 °C.
• Agentes desnaturalizantes: Compuestos como la urea y el cloruro de guanidinio pueden interferir con las interacciones hidrofóbicas y los puentes de hidrógeno, desestabilizando la estructura de la proteína.

Estudio del Mecanismo de Plegamiento de las Proteínas: Experimento de Anfinsen

El experimento clásico de Christian Anfinsen con la ribonucleasa A proporcionó información fundamental sobre el plegamiento de las proteínas:

1. La ribonucleasa A se trató con 2-mercaptoetanol (2ME) y urea. El 2ME reduce los puentes disulfuro, y la urea desestabiliza las interacciones hidrofóbicas, desnaturalizando la proteína.
2. Al eliminar el 2ME y la urea, la ribonucleasa A recuperó su estructura nativa y su actividad enzimática. Esto demostró que la información para el plegamiento correcto está contenida en la secuencia de aminoácidos.
3. Si se eliminaba el 2ME (permitiendo la formación de puentes disulfuro) antes de eliminar la urea, se formaban puentes disulfuro incorrectos y la proteína no recuperaba su actividad.
4. Si luego se añadía una pequeña cantidad de 2ME en ausencia de urea, los puentes disulfuro incorrectos se rompían y la proteína se replegaba correctamente, recuperando su actividad.

Conclusiones del experimento de Anfinsen:

• La secuencia de aminoácidos de una proteína contiene toda la información necesaria para su plegamiento correcto.
• Los puentes disulfuro se forman *después* de que la proteína ha alcanzado su conformación nativa, estabilizando la estructura.
• El plegamiento de proteínas no es un proceso aleatorio, sino que sigue una ruta específica determinada por la secuencia de aminoácidos. La estructura nativa (biológicamente activa) es la conformación termodinámicamente más estable.

Reacciones de Identificación y Cuantificación de Proteínas

• Reacción de Biuret: El Cu²⁺ reacciona con los enlaces peptídicos de las proteínas en medio alcalino, formando un complejo de color violeta. La intensidad del color es proporcional a la concentración de proteínas.
• Reactivo de Folin-Ciocalteu: Reacciona con los residuos de tirosina y triptófano de las proteínas, produciendo un color azul que se puede cuantificar espectrofotométricamente.

Enzimología: Acetilcolinesterasa y Método GOD-POD

• Acetilcolinesterasa (AChE): Es una enzima que hidroliza el neurotransmisor acetilcolina en colina y acetato.
• DTNB (5,5′-ditiobis-(2-nitrobenzoico)): Se utiliza para cuantificar la actividad de la AChE. El DTNB reacciona con la tiocolina (producto de la hidrólisis de la acetilcolina) generando un compuesto amarillo (ácido 5-tio-2-nitrobenzoico) que se puede medir espectrofotométricamente.
• Método GOD-POD: Se utiliza para medir la concentración de glucosa. La glucosa oxidasa (GOD) oxida la glucosa a ácido glucónico, generando peróxido de hidrógeno (H₂O₂). La peroxidasa (POD) utiliza el H₂O₂ para oxidar un cromógeno (como la o-dianisidina), produciendo un compuesto coloreado que se puede medir espectrofotométricamente.