Amplificación y Hibridación del ADN: Técnicas Fundamentales en Biología Molecular
La amplificación y hibridación del ADN son técnicas esenciales en biología molecular, con aplicaciones que van desde el diagnóstico de enfermedades hasta la investigación forense. A continuación, se describen algunas de las técnicas más importantes:
Amplificación del ADN
La amplificación del ADN es el proceso de aumentar el número de copias de una secuencia de ADN específica. Este proceso es fundamental para muchas aplicaciones, ya que permite obtener suficiente material genético para su análisis.
La PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) es una técnica in vitro que permite amplificar una región específica del ADN. Esta técnica es rápida, eficaz y ampliamente utilizada en diversos campos.
- Depende de una ADN polimerasa termoestable, como la Taq polimerasa, y requiere cebadores de ADN diseñados específicamente para la región de interés.
- La reacción se somete repetidamente a ciclos de cambios de temperatura que permiten la producción de muchas copias de la región blanco.
- Se utiliza de forma rutinaria en la clonación de ADN, el diagnóstico médico y el análisis forense de ADN.
Pasos para realizar PCR
- Extracción de ADN deseado
- Preparación de la mezcla de reacción
- ADN específico
- Conjunto de cebadores (oligonucleótidos sintéticos que flanquean la secuencia de ADN específica)
- ADN polimerasa termoestable (normalmente una polimerasa Taq)
- Nucleótidos
- Separación de alícuotas y agregado del ADN de interés
- Amplificación en Termociclador
- Desnaturalización: Se rompen los enlaces de hidrógeno de la cadena de ADN, transformando el ADN de doble cadena (dsADN) en ADN monocatenario.
- Hibridación: Los cebadores se unen a secuencias específicas.
- Extensión: La ADN polimerasa extiende el ADN desde los cebadores, creando nuevas cadenas de ADN bicatenarias.
- Electroforesis en gel de agarosa
- Observación en transiluminador UV
Descripción detallada de las etapas de la PCR
- Desnaturalización: Se calienta la muestra a 94-95 °C para separar las dos cadenas de ADN rompiendo los puentes de hidrógeno.
- Hibridación: Se baja la temperatura a 40-68 °C para permitir que los cebadores se unan a sus secuencias complementarias en el ADN molde.
- Elongación: La ADN polimerasa extiende el ADN desde los cebadores, sintetizando una nueva hebra complementaria a la hebra molde a una temperatura óptima de 72 °C.
Tipos de PCR
- PCR Anidada: Utiliza el producto de una primera amplificación como molde para una segunda amplificación con cebadores internos, aumentando la especificidad.
- PCR de Extensión Solapada (Mutagénesis): Introduce cambios de secuencia en fragmentos de ADN clonados.
- PCR in situ: Se realiza en secciones histológicas o células, permitiendo la visualización de los productos en el sitio de amplificación.
- PCR Múltiple: Amplifica simultáneamente más de una secuencia utilizando múltiples pares de cebadores.
- qPCR en Tiempo Real: Permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la muestra original.
- PCR Específica de Alelo: Identifica polimorfismos de una sola base (SNPs) utilizando cebadores específicos para las secuencias normal y mutante.
- PCR «Assembly»: Síntesis artificial de largas secuencias de ADN mediante PCR con oligonucleótidos largos y secuencias solapantes.
- PCR Asimétrica: Amplifica preferentemente una cadena del ADN original.
- PCR de Colonia: Examina rápidamente colonias de bacterias Escherichia coli para construcciones viables de vectores de ADN.
- PCR Hot-Start: Reduce la amplificación inespecífica durante las etapas iniciales de la PCR.
- PCR Específica de Intersecuencia (ISSR): Amplifica regiones entre repeticiones de secuencia simple para generar huellas genéticas únicas.
- PCR Inversa: Permite realizar la PCR cuando solo se conoce una secuencia interna.
- PCR Específica de Metilación (MSP): Detecta metilaciones en islas CpG de ADN genómico.
- PCR Cuantitativa: Mide la cantidad de un producto de PCR.
RFLPs (Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica)
Los RFLPs son polimorfismos que resultan de la variación en la secuencia de ADN reconocida por las enzimas de restricción. Se utilizan como marcadores en los mapas genéticos.
Técnicas de Hibridación del ADN
La hibridación de ácidos nucleicos (ADN o ARN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos para crear un híbrido con secuencias de bases complementarias en una única molécula de doble cadena.
El porcentaje de GC dentro de la cadena condiciona la temperatura de alineamiento y de desnaturalización.
- Hibridación Tipo Southern: Para uniones ADN-ADN.
- Hibridación Tipo Northern blot: Para uniones ADN-ARN.
Número Variable de Repeticiones en Tándem (VNTR)
Una repetición en tándem es una secuencia de dos o más bases de ADN que se repiten varias veces en forma de cadena en un cromosoma. Se utilizan como marcadores genéticos y en estudios forenses.
Hibridación Fluorescente in situ (FISH)
La Hibridación Fluorescente in situ (FISH) es una técnica citogenética de marcaje de cromosomas mediante la cual estos son hibridados con sondas que emiten fluorescencia, permitiendo la visualización y estudio de los cromosomas.