Técnicas de Identificación Rápida de Microorganismos
Las técnicas de identificación rápida son cruciales para microorganismos de difícil cultivo o en pacientes bajo tratamiento con antibióticos, especialmente en infecciones graves. Se clasifican en tres tipos principales:
A. Técnicas Inmunológicas
Basadas en la detección de antígenos (AG) o anticuerpos (AC). Incluyen:
1. Reacciones de Precipitación
En un intervalo limitado de concentración de AG y AC (zona de equivalencia), los anticuerpos se unen a los antígenos solubles correspondientes, formando una red tridimensional que precipita.
A) Precipitación en Líquido
En un medio líquido, la reacción de precipitación produce un precipitado en la zona de equivalencia entre la fase que contiene el AG y la fase que contiene el AC.
B) Inmunodifusión (Precipitación en Sólido)
a) Técnica de Inmunodifusión Simple
Se utiliza para cuantificar AG. Se emplea una placa de agar con pocillos como soporte sólido. El AC está en el agar y el AG a cuantificar en los pocillos. El AG difunde en el agar y, si hay reacción, forma un halo de precipitado medible.
b) Técnica de Inmunodifusión Doble
Se utiliza para determinar la relación entre diferentes AG o determinantes antigénicos. Se colocan soluciones de dos AG (uno patrón y otro problema) y una solución de AC en pocillos separados en agar, permitiendo que difundan para establecer gradientes de concentración. La zona de equivalencia forma una línea visible que se evalúa de cuatro formas:
- Si los dos antígenos son iguales, forman una forma Ʌ.
- Si un antígeno es igual y otro totalmente diferente, forman una forma Ʌ con una línea encima.
- Si los antígenos son totalmente distintos, forman una forma X.
- Si una parte del antígeno es parecida al otro, forman una forma Λ.
c) Técnica de Inmunoelectroforesis
Se utiliza para analizar AG complejos, que no son moléculas puras y están compuestos por diferentes determinantes antigénicos. Se busca identificar cuál de ellos reacciona con el AC. Se separan mediante una corriente eléctrica para encontrar el antígeno problema. Una vez separados, se añade el anticuerpo y se observa qué parte del AG reacciona con el AC.
2. Reacciones de Aglutinación
El AG o el AC se encuentran en una suspensión unidos a una partícula de gran tamaño. Se forma una aglutinación si la reacción es cruzada entre el AC y el AG. Se utilizan para titular un AC y existen dos tipos:
A) Reacción de Aglutinación Directa
El AG es normalmente insoluble y reacciona con el anticuerpo soluble, dando una aglutinación visible.
B) Reacción de Aglutinación Indirecta
El AC y el AG son solubles y se añade látex o carbono activo para insolubilizar una de las dos partes, aumentando la sensibilidad y especificidad.
3. Inmunofluorescencia
Se emplean AC marcados con fluoresceína que reaccionan con un AG. Si hay reacción cruzada, el AC emitirá fluorescencia al irradiar luz UV a la muestra. Existen dos tipos de técnicas:
A) Inmunofluorescencia Directa
Se utilizan AC comerciales marcados con fluoresceína que reaccionan con el AG del microorganismo. Si existe, se observa en el microscopio el complejo AC-AG teñido con fluoresceína.
B) Inmunofluorescencia Indirecta
Los AC pueden ser del suero del paciente o comerciales y se hacen reaccionar con el AG. Luego, se añaden inmunoglobulinas específicas del AC teñidas con fluoresceína. Si existe reacción cruzada, se observa en el microscopio el complejo inmunoglobulina-anticuerpo-antígeno teñido con fluoresceína. Es más específica y sensible que la directa.
4. Técnicas de Inmunoanálisis
Hay tres tipos de técnicas:
A) Enzimoinmunoanálisis (ELISA)
Se basan en la unión de una enzima mediante uniones covalentes a un AC. Se añade un sustrato, se revela y se obtiene una respuesta coloreada.
a) ELISA Directo
Se utiliza un AC comercial que queda adsorbido al fondo del pocillo. Luego, se añade una muestra del paciente que contiene el AG, creando un complejo anticuerpo-antígeno. Posteriormente, se añade una enzima unida a un anticuerpo específico del AG que se une al AG. Finalmente, se añade un sustrato que pueda utilizar la enzima y dar un producto coloreado visible.
b) ELISA Indirecto
Se utiliza un AG comercial que queda adsorbido al fondo del pocillo. Luego, se añade una muestra del paciente que contiene el AC, creando un complejo AC-AG. Posteriormente, se añade una enzima unida a una inmunoglobulina específica del AC que se une al AC. Finalmente, se añade un sustrato que pueda utilizar la enzima y dar un producto coloreado.
B. Técnicas Instrumentales
Basadas en las propiedades fisicoquímicas de los microorganismos. Ejemplo: la citometría de flujo.
C. Técnicas Moleculares
Basadas en la detección de secuencias de ácidos nucleicos (ADN o ARN) específicas de un microorganismo. Ejemplo: PCR.