1. Biosensores

Inmunoensayo de Fluorescencia

Unión de fluorescencia a anticuerpos específicos para una mejor identificación de los complejos Antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac). Los fluorocromos son sustancias que emiten un fotón cuando los excita un fotón incidente, emitiendo una señal de fluorescencia detectable por un receptor. Se acopla al microscopio de fluorescencia. En función de dónde se lleve a cabo el marcaje de las moléculas fluorescentes, se produce la inmunofluorescencia directa o indirecta.

Inmunofluorescencia Directa

Consiste en demostrar la presencia de un antígeno mediante reacción directa con un anticuerpo específico marcado con colorante fluorescente o fluorocromo. Los anticuerpos que se añaden directamente llevan unidos un fluorocromo, que emitirá una señal fluorescente detectable por un receptor cuando este se excita. Se observa la muestra en el microscopio de fluorescencia, y el microorganismo se verá brillando sobre un fondo oscuro.

Inmunofluorescencia Indirecta

Técnica de doble capa, se aplica el anticuerpo sin marcar sobre el sustrato de tejido y se visualiza por el tratamiento con un suero antiinmunoglobulina conjugado con fluorocromo.

Proceso:

1. Se fijan en portaobjetos los anticuerpos que constituyen el sustrato conocido específico y la muestra en disolución se coloca sobre él. Si la reacción es positiva se dará la formación de un complejo antígeno-anticuerpo no visible, ya que el anticuerpo no estaba marcado.
2. Se obtiene antiinmunoglobulina humana marcada que reaccionará con el anticuerpo del complejo. La inmunoglobulina debe tener una zona de unión al anticuerpo inicial añadido, la cual se marcará con fluoresceína u otro colorante. El anticuerpo marcado se unirá al anticuerpo humano no marcado, dando una reacción positiva de fluorescencia si en la primera etapa se produjo la unión entre el antígeno y el anticuerpo.

ELISA

Los métodos de enzimoinmunoanálisis (ELISA) combinan la especificidad de las moléculas de anticuerpos con la amplificación de la interacción antígeno-anticuerpo por catálisis enzimática, lo que permite detectar pequeñas cantidades del elemento diana.

El uso de enzimas como marcadores tiene ventajas: la enzima no se altera durante la actividad; puede catalizar la reacción de muchas moléculas de sustrato, amplificando la reacción y mejorando la detección. Los anticuerpos conjugados con la enzima son estables y pueden almacenarse durante un tiempo relativamente largo. La formación de un producto final coloreado permite la observación directa de la reacción o la lectura espectrofotométrica automatizada.

Los sistemas ELISA desarrollados para detectar agentes infecciosos contienen un anticuerpo firmemente unido a una matriz sólida. Solo pueden absorberse a la superficie pequeñas cantidades de proteína, la sensibilidad de los ELISA es tal que únicamente se requieren pequeñas cantidades de antígeno o anticuerpo.

Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa. Los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que solo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda.

Etapas:

1. Adsorción sobre soporte sólido: adsorción de uno de los componentes a un soporte sólido (el componente adsorbido puede ser antígeno o anticuerpo).
2. Reacción Ag-Ac: reacción inmunológica del antígeno o del anticuerpo adsorbido con la sustancia complementaria.
3. Unión con un conjugado enzimático: enzima ligada a una molécula capaz de reconocer el componente más superficial del complejo Ag-Ac adsorbido sobre la fase sólida. La enzima utilizada para marcar es la peroxidasa o la fosfatasa alcalina.
4. Reacción enzimática: reacción o catálisis enzimática al agregar el sustrato (cromógeno o fluorescente).
5. Lectura: lectura o revelado de la reacción enzimática, después de un lavado. Determinación cuantitativa (espectrométrica) del producto de la reacción enzimática.

Variantes para la detección de antígenos:

1. ELISA directo: permite la detección del antígeno problema a través de un anticuerpo específico que se encuentra conjugado con una enzima como sistema de marcado.
2. ELISA indirecto: el anticuerpo problema reacciona con los antígenos formando el complejo antígeno-anticuerpo. Un segundo anticuerpo marcado enzimáticamente reconoce al primero y se une al complejo.
3. ELISA en sándwich: en el primer paso se fijan al soporte anticuerpos específicos para el antígeno problema. Se añade la solución problema y los antígenos deben unirse a los anticuerpos. Se añaden anticuerpos específicos del antígeno marcado enzimáticamente que, al añadir el sustrato, producirán la catálisis enzimática.