Tipos de Sondas y Métodos de Marcaje
Las sondas son fragmentos de ADN o ARN diseñados para hibridar con una secuencia diana específica. Para que sean detectables, deben ser marcadas con distintos compuestos.
Tipos de Enzimas Usadas en el Procesamiento del ADN
Exonucleasas: Eliminan nucleótidos uno a uno desde los extremos 3′ o 5′ de la cadena de ADN.
Endonucleasas: Cortan dentro de la cadena de ADN. Algunas lo hacen de forma inespecífica, mientras que las enzimas de restricción lo hacen en secuencias específicas.
Métodos de Marcaje de Sondas
Existen varios métodos para marcar las sondas utilizando fluorocromos o isótopos radiactivos, permitiendo su detección en experimentos de hibridación.
Nick Translation
Se basa en la acción de la ADNasa I, que corta el ADN en lugares aleatorios formando «muescas» o nicks.
Luego, la ADN polimerasa I de E. coli se introduce en la muesca y:
Elimina nucleótidos en el extremo 5’.
Añade nucleótidos marcados en el extremo 3’.
Finalmente, la ADN ligasa repara la muesca y la sonda queda marcada.
Aplicación: Método eficiente para marcar grandes fragmentos de ADN.
Random Priming (Marcado al Azar)
Se desnaturaliza la molécula de ADN aplicando calor.
Se añaden hexanucleótidos (secuencias aleatorias de 6 nucleótidos), que se unen a la hebra desnaturalizada.
Se incorporan dNTPs marcados y sin marcar, que son añadidos por la ADN polimerasa del fragmento Klenow.
Se sintetizan alrededor de 400 nucleótidos marcados complementarios al ADN original.
Aplicación: Muy utilizado para obtener una alta intensidad de señal.
End-Labeling (Marcado en los Extremos)
Se usa en fragmentos pequeños de ADN (<200 bases).
Marcaje en el extremo 5’:
Se elimina el grupo fosfato con una enzima fosfatasa.
Luego, con una enzima quinasa y dNTPs marcados, se añaden grupos fosfato marcados al extremo 5′.
Aplicación: Ideal para marcar fragmentos cortos y estudiar interacciones ADN-proteína.
Factores Claves en la Hibridación
Longitud de las cadenas:
Hebras más largas → Mayor estabilidad (más puentes de hidrógeno).
Complementariedad:
Se permite un porcentaje de errores en el emparejamiento.
Si hay menos del 70% de complementariedad, la unión será débil.
Composición de la sonda:
Más Guanina y Citosina (G-C) → Más estabilidad.
Más Adenina y Timina (A-T) → Menos estabilidad.
Temperatura:
Las bases G-C tienen 3 puentes de hidrógeno → Se necesitan temperaturas más altas para desnaturalizar el ADN.
Promedio de temperatura para romper enlaces: 90°C ± 5°C.
pH:
Un pH alto (>11) rompe los puentes de hidrógeno y separa las hebras de ADN.
Productos químicos:
Sustancias como la urea neutralizan los grupos fosfato y facilitan la separación de las hebras.
Concentración de la sonda:
Mayor concentración de sonda → Mayor probabilidad de hibridación con la hebra original.
Técnicas de Transferencia e Hibridación de Ácidos Nucleicos en Soporte Sólido
Southern Blot
Es una técnica para detectar secuencias de ADN específicas en una muestra biológica.
Procedimiento del Southern Blot
Digestión del ADN
Se corta el ADN con una enzima de restricción.
Electroforesis en gel
Se separan los fragmentos de ADN según su tamaño en un gel de agarosa.
Fragmentos pequeños → Se desplazan más rápido.
Transferencia a una membrana
El ADN del gel se transfiere a una membrana de nylon o nitrocelulosa.
Hibridación con una sonda marcada
Se expone la membrana a una sonda de ADN marcada con:
Sustancia radioactiva.
Fluoróforo.
Reactivo químico.
Visualización
Se detectan las bandas de ADN que hibridaron con la sonda, confirmando la presencia de la secuencia buscada.
Aplicación: Identificación de mutaciones genéticas, estudios de paternidad y diagnóstico molecular.
Northern Blot
Objetivo:
Detectar y analizar la expresión de genes a través del ARN mensajero (ARNm).
Procedimiento del Northern Blot
Extracción del ARN
Se aísla el ARN total o ARNm de una muestra biológica.
Electroforesis en gel
Se separan los fragmentos de ARN según su tamaño.
Se usa gel de agarosa con formaldehído para evitar la formación de estructuras secundarias.
Transferencia a una membrana
El ARN se fija en una membrana de nylon o nitrocelulosa.
Hibridación con una sonda marcada
Se utiliza una sonda de ARN o ADN marcada (radioactiva, fluorescente o química).
Visualización y análisis
Se detectan las bandas correspondientes a los ARN mensajeros de interés.
Aplicación: Estudio de expresión génica, enfermedades genéticas, respuesta celular a estímulos, etc.
Microarrays («Chips de Genes»)
Objetivo:
Analizar la expresión de múltiples genes al mismo tiempo y detectar alteraciones genéticas.
Aplicaciones:
Investigación en cáncer, enfermedades genéticas, farmacología y diagnóstico médico.
Identificación de genes implicados en trastornos como el autismo o el déficit intelectual.
Procedimiento del Microarray de Dos Colores
Preparación de muestras
Se extrae ARNm de la muestra control y de la muestra experimental.
Síntesis de ADNc
Se obtiene ADN complementario (ADNc) a partir del ARNm, usando transcriptasa inversa.
Se marcan con fluorocromos:
Verde → Muestra control.
Rojo → Muestra experimental.
Hibridación
Se colocan las muestras marcadas en el chip de microarrays.
El ADNc de la muestra hibrida con los oligonucleótidos complementarios en el chip.
Escaneo y análisis de datos
Un láser excita los fluorocromos, generando una imagen que muestra la expresión génica.
Interpretación de colores:
Amarillo → Expresión similar en ambas muestras (sin alteración).
Verde → Expresión mayor en la muestra control.
Rojo → Expresión mayor en la muestra del paciente.
Ventajas de los Microarrays:
Alta capacidad de análisis → Miles de genes en un solo experimento.
Identificación rápida de mutaciones y alteraciones genéticas.
Técnicas de Hibridación en Cromosomas y Tejidos
Hibridación In Situ (ISH)
Objetivo: Detectar secuencias específicas de ADN o ARN en cromosomas, células o tejidos.
Principio básico:
Desnaturalización de los ácidos nucleicos para permitir la unión de una sonda complementaria.
La sonda marcada permite la detección mediante microscopía de fluorescencia o campo claro.
Tipos de hibridación in situ:
Hibridación estándar: La sonda está marcada, por lo que emite la señal directamente.
Hibridación inversa: La sonda marca la célula diana, y esta es la que emite la señal.
Hibridación In Situ con Marcaje Fluorescente (FISH)
Objetivo:
Identificar alteraciones cromosómicas, enfermedades virales y cáncer.
Principio:
Se utilizan sondas de oligonucleótidos marcadas con fluorocromos.
Tras la hibridación, se observa la señal fluorescente en un microscopio de fluorescencia.
Aplicaciones:
Diagnóstico de alteraciones cromosómicas (ej. trisomía 21, deleciones, translocaciones).
Identificación de virus en tejidos.
Estudios en oncología molecular.
Ventaja:
Permite un análisis rápido y preciso de material genético en cromosomas y tejidos.
Hibridación In Situ Cromogénica (CISH)
Objetivo:
Detectar secuencias de ADN/ARN con marcaje enzimático en lugar de fluorescente.
Principio:
Las sondas se marcan con un resto antigénico y se detectan con anticuerpos conjugados con enzimas.
Las enzimas catalizan una reacción que genera un precipitado cromogénico estable.
Se visualiza mediante un microscopio de campo claro estándar.
Ventajas sobre FISH:
Más económico y fácil de usar.
Muestras estables, sin degradación con el tiempo.
Permite visualizar la estructura celular junto con la señal de la sonda.
Aplicaciones:
Diagnóstico oncológico y patológico en tejidos.
Estudios de alteraciones cromosómicas.
Hibridación In Situ Mejorada con Plata (SISH)
Objetivo:
Variante de CISH donde se usa depósito de plata en lugar de fluorocromos o enzimas colorimétricas.
Principio:
La sonda está vinculada a una enzima que genera depósitos de plata en el sitio objetivo.
El resultado es una señal negra estable y de alta resolución.
Ventajas sobre FISH y CISH:
Más rápido que los métodos fluorescentes.
Alta estabilidad química → Permite almacenar muestras por más tiempo.
Fácil de visualizar con un microscopio convencional de campo claro.
Aplicaciones:
Diagnóstico de cáncer y anomalías cromosómicas.
Estudios en patología molecular.