2/obtención de fragmentos de adn:
el primer paso en todo proceso de ing genética es la obtención del gen o del fragmento de adn que tiene interés, y se puede hacer mediante:
-tecnología del adn recombinante
Corta la molécula de adn por lugares concretos para luego unir los fragmentos con un adn diferente, para obtener una sola molécula de adn llamada transgen. Esto se desarrollo a partir del descubrimiento de las enzimas de restricción, que reconocen en el adn el sitio de restricción, para cortar las dos cadenas de nucleotidos dentro de este sitio, que suelen ser simétricos y la secuencia se lee en ambas direcciones (palindromica). La enzima ecor1 corta el adn solo donde se encuentra la combinación de bases GAATTC, entre las bases G y A. Moléculas de adn de distinto origen cortadas con la misma enzima de restricción pueden unirse por enlaces de H que son temporales, pero se pueden hacer permanentes con adn ligasa. La unión de adn de dos orígenes distintos, catalizada por la adn ligasa produce una molécula de adn recombinante. Mediante esta tecnología se pueden obtener fragmentos de adn que lleven incorporados un gen de ineres, e incorporarse a las células de otros organismos en los que expresara la información contenida.
-formación de un adn complementario por hibridación:
la molécula de adn es estable, pero las dos hebras se pueden separar alterando el ph por encima de 13 o calentando por encima de 100º, esto se llama desnaturalización, debido a la ruptura de enlaces de H y que la hélice se desenrrolla. Esto es reversible, manteniendo las hebras a unos 65º, formándose una nueva hélice(renaturalizacion o hibridación del adn), y dos hebras de distinta procedencia lo pueden hacer también. Mediante desnaturalización primero y luego renaturalizacion se pueden obtener moléculas hibridas a partir de dos hebras de cualquier tipo de adn o arn, siempre que entre ellas haya una secuencia complementaria. Cuanto mas relacionados estén los adn, mayor porcentaje de renaturalizacion hay. Cuando el adn es de distintas especies habrá mayor hibridación cuanto mas relacionadas estén evolutivamente. Estas técnicas sirven para detectar secuencias complementarias, localizar genes relacionados en distintas poblaciones, diagnosticar enfermedades genéticas..
-síntesis de un ADNc utilizando como molde el ARNm:
el principal objetivo de la tecnología del adn recombinante es obtener múltiples copias de un gen de interés, cuando se trata de eucarioticos, la utilización de enzimas de restricción comportaría obtener muchos fragmentos de adn formados por intrones y exones. La transcripción de estos origina un arnm que debe ser sometido a una maduración en el que se eliminan los intrones, esto no ocurre en procariotas. Gracias a la enzima transcriptassa inversa, es posible sintetizar un adn de cadena sencilla utilizando como molde un arnm maduro. Este adnc sirve mas tarde como molde para obtener otro adnc, de doble cadena y no tiene intrones y puede traducirse por bacterias.
3/clonación del adn:
es un proceso extendido en la naturaleza y consiste en la producción de individuos geneticamente idénticos mediante reproducción asexual. Referido al adn consiste en producir múltiples copias de un gen especifico dentro de un organismo hospedador. La mayoría se hace con procariotas como hospedadores, y debe reunir unas determinadas características: -debe ser de crecimiento rápido y en medio de cultivo económico. -no debe ser patógeno. -debe favorecer la entrada del transgen. -se debe tener de el amplio conocimiento y ser manipulable. Para incorporar el gen se usan vectores de clonación(moléculas de adn capaces de transportar adn extraño y replicarse dentro del hospedador), que deben tener características comunes y llevar su propio origen de replicación; deben portar genes marcadores(para su identificación). Los vectores mas utilizados son: -plasmidos: pequeñas moléculas de adn bicatenario y circular, se pueden replicar y llevan genes que le dan resistencia a antibióticos. -virus bacteriófagos: infectan bacterias. Los mas usados son los lambda, que llevan mas adn que un plasmido. Se usan debido a que en la transducción algunos genes de la bacteria huésped pueden incorporarse a su genoma. -cosmidos: vectores híbridos y su adn se puede replicar como un plasmido o empaquetarse como un fago. Tienen resistencia a antibióticos, replicación, y sitios de restricción. La ventaja es que llevan mas adn foráneo que los plasmidos.
4/identificación de clones mediante sondas:
las sondas son pequeños oligonucleotidos de cadena sencilla, formados por unos 20 nucleotidos que se hibridaran con cualquier adn recombinante que tenga la secuencia de bases complementaria. Se pueden obtener sintéticamente siempre que se conozca una parte de la secuencia de bases del gen de interés o bien la secuencia de aminoácidos de la proteína que codifica. La sonda se marca con una molécula fluorescente para poder localizarla.