Técnicas de Separación Bioquímica y Metabolismo

Electroforesis

La electroforesis es un fenómeno que se produce cuando se aplica una diferencia de potencial a una disolución macromolecular o a una suspensión de partículas con carga superficial. Estas partículas migrarán en el medio en que están suspendidas o disueltas a velocidades que serán función de su carga neta y de su resistencia al movimiento, es decir, de su tamaño y forma.

Desarrollo Práctico

• Soportes: tiras de acetato de celulosa
• Buffer: borato sódico pH: 8.6
• Voltaje: 3 A a 200V
• Color de corrida: Rojo Ponceau o negro amido
• Observación: albúmina, α-1-globulina, α-2-globulina, β-globulina, γ-globulina

Factores que Afectan la Movilidad Electroforética

1. Fuerzas:
   • Eléctrica: Hace que la partícula migre al polo opuesto de su carga y depende del voltaje y de la carga (Q).
   • Resistencia: Determinada por la viscosidad del medio en el que migra, así como el tamaño, forma y velocidad de la partícula.
2. pH: La carga de una sustancia varía con el pH y, por lo tanto, varía su movilidad. En un ambiente básico, la carga es negativa.
3. Peso y forma de la molécula
4. Carga y conformación
5. Atmósfera iónica: Al moverse los iones contrarios, restan movilidad a la macromolécula y aumentan la fuerza friccional sobre ellas.
6. Electrolitos: Proveen un medio eléctrico constante.
7. Conductividad: Es la inversa de su resistencia al paso de la corriente.
8. Efecto electroendosmótico: En pH alcalino, las proteínas están cargadas negativamente y se mueven hacia el ánodo (+). El soporte se carga negativamente y provoca una atracción de las cargas positivas del ánodo, creando una corriente de tampón llamada flujo electroendosmótico, contrario al movimiento electroforético, reduciendo la migración y, por lo tanto, la resolución de los compuestos proteicos que migran más velozmente hacia el ánodo, y mueve hacia el cátodo las fracciones de baja movilidad.
9. Medios de soporte

Visualización

Habitualmente se emplea un indicador del frente de corrida (un colorante), que en este caso viene incluido con el buffer. Se usa un colorante con gran afinidad por las proteínas, como es el negro amido.

Clasificación

• Clase 1: Separa moléculas por carga neta (papel, acetato de celulosa, agarosa).
• Clase 2: Separa por tamaño y carga: gel de almidón, poliacrilamida. Estos geles son porosos y su tamaño de poro es del mismo orden que las moléculas de las proteínas.

Colorantes

• Ninhidrina (aminoácidos)
• Rojo Ponceau/Negro Amido (proteínas)
• Rojo Oleoso (lipoproteínas)
• PAS (glucoproteínas)
• Bromuro de etilo (ácidos nucleicos)
• Ferrocianuro (hemoglobina)
• NADH (isoenzimas)
• Azul de Coomassie (inmunoglobulinas)

Gráfico: ánodo (+) albúmina, alfa1,2 beta gama cátodo (-), corrida del cátodo al ánodo.

Cromatografía

La cromatografía es una técnica que separa una mezcla de solutos basándose en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria.

• Fase móvil: (líquida o gaseosa) fluido que arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria.
• Fase estacionaria: (sólida o líquida fijada en sólido).

Clasificación según la Fase Estacionaria

• Cromatografía de adsorción: La muestra se coloca sobre la fase estacionaria sólida sobre la cual se adsorberán los componentes por acción de fuerzas electrostáticas. Se hace pasar una fase móvil sobre el sólido, estableciéndose una competencia por las sustancias de la muestra entre la fase estacionaria y la fase móvil. Dependiendo de las características de cada compuesto de la muestra, algunos tenderán a quedarse más retenidos en el sólido, mientras que otros avanzarán con el paso del solvente.
• Cromatografía de partición: Tanto la fase móvil como la fase estacionaria son líquidas, estando la fase estacionaria sobre un soporte sólido. Se establecen pequeños equilibrios de distribución sucesivos entre dos fases líquidas.
• Cromatografía en capa fina: Es una técnica capaz de separar los componentes de una muestra entre dos fases: una móvil (líquida) y otra estacionaria (líquida o sólida) que forma una capa de material poroso de un espesor determinado sobre un soporte plano inerte.

Absorbentes Utilizados

Silicagel, Alúmina, Tierra silícea, Celulosa, Poliamidas. Condiciones: tamaño de partícula (volumen de poro), homogeneidad y pureza.

Soportes

Láminas de vidrio, plástico o metálico.

Métodos de Revelado

Químico (por inmersión), físico (óptico, radiación UV).

Desarrollo Práctico (TLC)

• Fase estacionaria: Placas de TLC de Silicagel.
• Fase móvil: n-butanol, ácido acético, agua (4:1:1), apolar.
• Soporte: aluminio.
• Reveladores: ninhidrina en etanol absoluto.

Etapas

1. Aplicación de la muestra a analizar.
2. Elución de la muestra y patrones.
3. Secado y revelado de los aminoácidos.
4. Caracterización de los aminoácidos de la muestra problema.

Aminoácidos

• No polares: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano, tirosina, metionina.
• Polares: cisteína, serina, treonina, asparagina, glutamina, aspártico, glutámico, histidina, lisina, arginina.

Zimografía

Es una técnica electroforética que permite observar la actividad de enzimas. Se realiza con poliacrilamida y, a diferencia de la electroforesis de proteínas en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), se trata de utilizar condiciones suaves (sin agentes reductores) para evitar la pérdida de actividad de las enzimas estudiadas.

Sistemas de Electroforesis

• Sistema continuo: La concentración del gel, el pH y la fuerza iónica quedan fijos.
• Sistema discontinuo: Se utilizan dos geles, la concentración de los geles y los tampones que se usan para la preparación son diferentes. El primer gel (espaciador) asegura la migración de todas las proteínas en el frente de migración, provocándose la acumulación de las mismas en el pocillo, es de mayor poro y tiene un pH más ácido. La separación se realiza en el segundo gel (resolución).

Electroforesis en Geles de Poliacrilamida

Los geles se forman por la polimerización vinílica del monómero acrilamida y del monómero entrecruzador N,N-metilenbisacrilamida. La polimerización es iniciada por el persulfato de amonio (APS) y el TEMED que cataliza la formación de radicales libres del persulfato de amonio, para iniciar el proceso. Los radicales libres del persulfato convierten los monómeros de acrilamida en radicales libres que van reaccionando con monómeros de acrilamida no activados, para formar cadenas lineales de poliacrilamida. La bisacrilamida introduce enlaces cruzados entre las cadenas lineales, generando un entramado con poros (O2 inhiben, se deben desgasificar los reactivos para obtener geles reproducibles).

SDS-PAGE

La separación de proteínas utilizando geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes consiste en la separación de las mismas por su peso molecular. Cuando a las muestras se les añade SDS, las proteínas se desnaturalizan y, además, el SDS tiene la capacidad de unirse a los aminoácidos. Así, la carga de los péptidos se hace insignificante ante el exceso de carga negativa del SDS y todos adquieren una carga neta igual, de modo que la separación será por tamaño molecular.

Geles No Desnaturalizantes

El sistema está diseñado de tal forma que se mantiene la conformación nativa de las proteínas, las interacciones entre sus subunidades y su actividad biológica. La separación de las proteínas en estado nativo ocurre de acuerdo al tamaño y la carga intrínseca.

Inductor

Para distintas enzimas o proteínas que no se pueden apreciar con otro revelador.

Preparación de Geles

• Buffer gel separador: Tris-HCl pH: 8.8
• Gel concentrador: Tris-HCl pH: 6.8, glicerol o sacarosa, azul de bromofenol.
• Corrida electroforética: Tris-HCl pH: 8.3, glicina.
• Solución de acrilamida: N,N-metilenbisacrilamida 30%.

Detección de Lacasa

Solución de fijación: metanol 40%, ácido acético 10% y csp. Sumergir gel en DMP (Dimetoxifenol) sustrato específico de lacasa, buffer acetato pH: 3.5, se ven bandas anaranjadas.

Pasos para la Electroforesis

1. Ensamblar vidrios.
2. Añadir gel separador.
3. Añadir agua y dejar gel edificarse.
4. Añadir gel concentrador.
5. Colocar peine y dejar polimerizarse.
6. Retirar peine.

Nucleótidos

Ácido fosfórico, azúcar, base: purinas y pirimidinas.

Regulación de la Síntesis

Purinas

• Participan: glicina, CO2, ácido tetrahidrofólico, amina del aspartato.
• Sustrato: Ribosa-5-P.
• Enzima control: PRPP amidotransferasa.
• Inhiben: IMP, ATP, GTP, ADP, GDP, GMP, AMP.
• Activa: Pi.
• Control cruzado: ATP estimula GMP, GTP estimula AMP (retro). Ribosa5P – FosfoRibosilPiroP – FosfoRibosilAmin – IMP – izq: amp-adp-atp, derech: gmp, gdp. Gtp. Enz PRPP sintetasa, activa: atp. Inhibe: gmp, gdp, amp, adp. Imp.

Pirimidinas

• Carbamil-P y aspartato.
• Sustrato: glutamina.
• Enzima control: aspartato transcarbamilasa.
• Inhibe: UTP, CTP.
• Activa: carbamilfosfato, ATP. Se adhiere aspartato (citoplasma). Isoenzima 1: ciclo urea (mitocondrial). Isoenzima 2: biosíntesis de pirimidinas (citoplasmáticas). Participan: glutamina, carbamilfosfato, CO2, aspartato.

Interrelación Metabólica

Objetivo: Formar ATP, formar precursores para la biosíntesis de otras sustancias, formar poder reductor: NADPH principal dador de electrones en las biosíntesis reductoras.

Combustibles

• Glucosa (glóbulos rojos, cerebro, retina)
• Ácidos grasos libres (músculo esquelético y cardíaco)
• Cuerpos cetónicos (cerebro y músculo cardíaco)
• Aminoácidos (por dieta + importante: alanina, por catabolismo de proteínas)
• Ácido láctico (glucólisis)
• Fuentes menores: glicerol, pentosas.

Metabolismo de las Principales Vías

• G-6-P: VHMP (ribosa-5-P + NADPH), Glucogenogénesis (glucógeno), Glucólisis (piruvato + ATP) todo en cito.
• AcetilCoA: Biosíntesis de ácidos grasos (cito), formación de cuerpos cetónicos (mito), forma ésteres de colesterol (cito).
• Glicerol-3-P: Vía glucolítica, síntesis de triglicéridos.
• Piruvato: Biosíntesis de purinas, gluconeogénesis (cito y mito), lactato (glucólisis), acetilCoA- Dop (mito).

Mecanismos de Regulación Metabólica

Interrelacionalostérica, mod covalente (control fino), niveles enzimáticos, compartimentación, especialización metabólica en órganos (hígado, músculo, tejido adiposo), fosfo-desfosforilación oxidativa, hidra-deshidra, transcripcional (control grueso).

Regulación Metabólica

• Señal intercelular: alostérica ocurre en milisegundos. NADH/NAD, Ca+, acetilCoA, ATP, G6P, citrato.
• Señal extracelular: covalente, ocurre en segundos o minutos. Insulina, glucagón y adrenalina.

Ciclos Metabólicos

• Ciclo de Cori: Forma de interrelación metabólica ya que relaciona dos órganos, músculo e hígado. El hígado tiene G6Pasa y puede liberar glucosa a sangre cuando sea necesario, pero el músculo no, y por ello depende del hígado para su funcionamiento (ejercicio intenso y corto).
• Ciclo de la Alanina: También interrelaciona músculo e hígado. Ocurre en cada comida con la función de mantener los niveles de glucosa en sangre, y permite eliminar el grupo amino de los aminoácidos por urea en el hígado. En menor medida ocurre en ejercicio intenso y corto.

Estados Metabólicos

• Post Absorción: Aumento de glucosa, liberación de insulina, estimulación: glucogenogénesis, glucólisis, lipogénesis, menos oxidación de ácidos grasos, mayor formación de triglicéridos.
• Ayuno Corto: Glucosa disminuye, liberación de glucagón (páncreas), inhibe transporte de glucosa a las células, estimulación: glucogenólisis y lipólisis. Inhibición: glucólisis, triglicéridos. Toma importancia la gluconeogénesis sintetizando glucosa a partir de aminoácidos del tejido muscular.
• Ayuno Prolongado: Forma de glucosa por gluconeogénesis por tejido muscular, degradación de ácidos grasos, aumento de oxidación de ácidos grasos, acetilCoA y cuerpos cetónicos (para cerebro).
• Inanición: Día 1: cambios como ayuno nocturno, día 3: gran aumento cetónicos (1/3 de cerebro). Más días: cuerpos cetónicos principal fuente de energía para el cerebro. Gluconeogénesis para formar glucosa. Finalmente se utilizan ramificados para reducir al mínimo su catabolismo, permitiendo controlar el catabolismo de proteínas.

Ejercicio

• Corto e intenso: Glucólisis anaeróbica, Ciclo de Cori, Intensificación de la desfosforilación del ATP almacenado a ADP. La creatina fosfato transfiere rápidamente un fosfato de elevado potencial.
• Prolongados: Procesos anaeróbicos y aeróbicos. Primero se utilizan las reservas del glucógeno del músculo. Cuando se agota esta reserva, el combustible dominante son los ácidos grasos.