Técnicas de Separación y Análisis Bioquímico

Cromatografía de Intercambio Iónico

Durante una cromatografía de intercambio iónico, la propiedad de las moléculas que se utiliza para facilitar su separación es la carga neta superficial que presentan a un pH determinado. La separación se basa en la adsorción reversible de los analitos con carga (iones) a grupos iónicos de carga opuesta presentes en la fase estacionaria (gel intercambiador). En este caso, el analito adsorbido se une al intercambiador mediante fuerzas electrostáticas. El término “adsorción” hace referencia a que las moléculas quedan atrapadas o retenidas en una superficie.

Determinación de la Actividad Enzimática

La cantidad de una enzima pura puede ser expresada en moles o en unidades de masa, como las de cualquier otro compuesto químico. Pero también puede ser cuantificada en términos de actividad enzimática. En el primer caso, se contabiliza la cantidad total de la proteína, en tanto que en el segundo caso, se determina qué nivel de proteína activa está presente en la muestra, el cual no necesariamente constituye el total de las moléculas de proteína presentes en la muestra. La actividad enzimática de una cantidad de enzima definida se puede calcular determinando por algún método la cantidad de sustrato que se convierte en producto por unidad de tiempo. Generalmente, la actividad enzimática se expresa en unidades de enzima (U).

Métodos para Medir la Actividad Enzimática

• Método continuo-directo: Se utiliza cuando la actividad de la enzima se puede seguir midiendo cambios en la absorbancia, turbidez, fluorescencia, viscosidad, pH u otros posibles parámetros físicos en función del tiempo. Para este tipo de método se utilizan, por ejemplo, sustratos artificiales que generan productos coloreados o fluorescentes luego de la acción de la enzima en estudio.
• Método continuo-acoplado: Se utiliza en los casos donde la enzima a estudiar no genera ningún cambio en los parámetros físicos medibles directamente. En estos casos se utiliza un método continuo acoplado en el cual el producto generado por la enzima en estudio es utilizado como sustrato por otra enzima cuyo producto sí puede ser detectado por parámetros físicos medibles.

Ensayos de Cuantificación de Proteínas

Ensayo de Bradford

El ensayo de Bradford se basa en la unión no covalente del Azul de Coomassie a las proteínas. Este compuesto presenta diferentes espectros de absorción según el estado de protonación en el que se encuentra: la forma catiónica es de color rojo amarronado (máximo de absorbancia a 470 nm), la neutra es verde (máximo a 650 nm) y la aniónica es azul (máximo a 595nm). La presencia de proteínas favorece el desplazamiento del equilibrio hacia la forma aniónica debido a la interacción de los grupos sulfónicos del Coomassie con los grupos catiónicos de las cadenas laterales de algunos residuos aminoacídicos de las proteínas (principalmente Arg y Lys). Esto genera la coloración azul del reactivo, que puede medirse a 595 nm. La intensidad del color azul aumentará al aumentar la concentración de proteína. Las principales ventajas de este ensayo son su alta sensibilidad (detecta entre 1-10 µg por mL) y sencillez. El método de Bradford es un método indirecto porque no mide la concentración de proteína, sino que mide la absorbancia y, en base a eso, se obtiene la concentración.

Método de Biuret

El método del Biuret tiene la ventaja de que no depende del tipo de aminoácidos presente en las proteínas de la muestra, ya que en la reacción interviene el enlace peptídico y no las cadenas laterales de los mismos. Sin embargo, comparado con otros métodos disponibles, el método del Biuret resulta poco sensible, ya que cada ensayo requiere una concentración de proteína superior a 100 microgramos/mL.

Actividad Específica de una Enzima

La actividad específica (AE) de una enzima se refiere a la actividad de dicha enzima por unidad de masa de proteína presente en la muestra, y se suele expresar en U/mg de proteína. La actividad específica nos permite tener una idea de la pureza de la enzima en estudio cuando esta es determinada en las diferentes muestras que se obtienen a lo largo de una purificación. Esto se debe a que para una muestra en particular, nos informará cuánta enzima está activa por cada mg de proteína total. Si con los pasos de purificación se van eliminando proteínas contaminantes, quedando la muestra cada vez más enriquecida en la enzima, la relación de unidades de enzima/mg de proteína debe aumentar. De esta forma, la AE permite evaluar el éxito de un proceso de purificación de una enzima, ya que a través de dicho proceso lo que buscamos es tener la mayor cantidad de enzima con respecto a las demás proteínas (“impurezas”). El procedimiento de purificación “más exitoso” será aquel con el que se logre alcanzar la más alta AE. Por lo tanto, para calcular la AE (ecuación 1) es necesario determinar: por un lado la actividad/mL (U/mL) de muestra (“concentración de enzima activa”) a partir de los resultados de un ensayo de actividad enzimática y por otro lado la concentración de proteínas (mg de proteína/mL de muestra) a partir de un ensayo de cuantificación de proteínas.

Actividad Específica = (Actividad /mL de muestra) / (mg de proteína /mL de muestra) = U /mg de proteína.

Ecuación 2: Factor de Purificación = Actividad específica en la etapa de purificación «X» / Actividad específica en la etapa inicial.

Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE)

Los geles de poliacrilamida están formados por largas cadenas de poliacrilamida interconectadas entre sí por puentes químicos o entrecruzamientos (generando algo similar a una matriz con poros). Estos geles se obtienen mediante la co-polimerización de moléculas de acrilamida (que forman cadenas lineales) y el compuesto bifuncional bisacrilamida que puede formar parte de dos cadenas (“agente entrecruzador”), creando así un entramado tridimensional. La mera mezcla de acrilamida y bisacrilamida no genera la formación del gel, sino que es necesario el agregado de un iniciador de la reacción de polimerización y un catalizador, como el persulfato de amonio (APS) para iniciar la reacción de polimerización y TEMED para catalizar la propagación de la misma. Variando la concentración de acrilamida y bisacrilamida se pueden obtener geles con poros de tamaños determinados.

SDS-PAGE

SDS-PAGE es una técnica utilizada para separar las proteínas de acuerdo a su movilidad electroforética (en función de la longitud de la cadena polipeptídica, masa molecular, modificaciones postraduccionales y otros factores). Gracias al SDS (detergente más utilizado es el dodecil sulfato de sodio) las proteínas se desnaturalizan, perdiendo su conformación tridimensional. De este modo se obtiene un fraccionamiento que obedece a: la diferencia de peso; la longitud de la cadena (tamaño); y la forma de la proteína.

Electroforesis Nativa

En esta metodología se procuran condiciones en las cuales las proteínas no se desnaturalicen, es decir, que mantengan su estructura nativa. De esta manera, en muchos casos es posible mantener intactos los complejos supramoleculares que puedan formar algunas proteínas, o conservar la estructura cuaternaria en proteínas oligoméricas. Este tipo de electroforesis, al no desnaturalizar la muestra, permite realizar ensayos bioquímicos posteriores a la separación.

Extracción de ADN

La extracción de ADN supone separar el ADN del resto de los componentes celulares para su purificación. Los métodos clásicos de extracción de ADN implican los siguientes pasos: i) lisis celular y homogeneización de la muestra, ii) separación del ADN de proteínas y restos celulares, y iii) precipitación del ADN. La pureza lograda determinará qué tan eficientes serán las reacciones enzimáticas posteriores que usen ese ADN como sustrato o molde. El último paso en la purificación del ADN implica su precipitación. Ésta permite: (i) eliminar contaminantes, (ii) cambiar el disolvente en el cual se encuentra y (iii) concentrar el ADN. El método más comúnmente utilizado es la precipitación alcohólica que requiere la presencia de dos elementos:

1. Un alcohol (ej. etanol o isopropanol) que remueve la capa de solvatación que rodea el ADN, dejando expuestas las cargas negativas de los grupos fosfato
2. Cationes provenientes de sales que neutralizan las cargas negativas de los grupos fosfatos.

Plásmidos y Lisis Alcalina

Los plásmidos son moléculas de ADN circulares y covalentemente cerradas que pueden encontrarse en las bacterias. A diferencia del cromosoma bacteriano, que contiene toda la información básica para el funcionamiento celular y que tiene un gran tamaño molecular, los plásmidos suelen ser de menor tamaño y portan genes que le confieren una ventaja adaptativa a la bacteria: resistencia a antibióticos, nuevas habilidades metabólicas, factores de virulencia, entre otros. En general, los plásmidos se replican independientemente del cromosoma y suelen encontrarse en un número de copias característico por célula, dependiendo del tipo de plásmido. La purificación de ADN plasmídico es una práctica corriente en el laboratorio y uno de los métodos de extracción más conocidos es el de “lisis alcalina”. Este método aprovecha las diferencias en tamaño del ADN plasmídico y cromosómico para poder separarlos. El paso clave que permite la separación del ADN plasmídico del cromosómico es la neutralización rápida del pH de la solución por el agregado de un ácido y el ión potasio. Este método de extracción de ADN plasmídico se basa entonces en la renaturalización diferencial del ADN plasmídico, quedando el ADN cromosómico en el precipitado mientras el ADN plasmídico permanece en solución.

Espectrofotometría y Pureza del ADN

Para estimar la concentración de los ácidos nucleicos en solución se utiliza fundamentalmente la espectrofotometría. La forma habitual de evaluar la pureza respecto de proteínas se basa en la diferencia en los máximos de absorción de los ácidos nucleicos (260 nm) y de las proteínas (280 nm). Así, para una preparación dada se determina su absorbancia a 260 nm y a 280 nm y se calcula el cociente A260/A280. En general, se considera que la preparación es de buena calidad en relación al grado de pureza cuando:

• ADN A260/A280 ≥ 1,8
• ARN A260/A280 ≥ 2,0

La electroforesis es una técnica complementaria que permite evaluar la calidad de una extracción por visualización de los ácidos nucleicos en un gel.

Conformaciones del ADN Circular

Las distintas conformaciones de un mismo ADN circular tienen la particularidad de migrar distinto en una electroforesis. Así, la conformación superenrollada migra una mayor distancia en el gel que la forma lineal debido a su estado compacto. Por el contrario, la forma circular relajada se retrasa en el gel respecto de la lineal. Por lo tanto, moléculas de ADN de igual tamaño e idéntica secuencia nucleotídica migran en una electroforesis con diferente velocidad en función de su conformación.