Técnicas de Siembra y Cultivo de Microorganismos: Fundamentos y Procedimientos

La siembra es el proceso de introducir microorganismos en un medio de cultivo adecuado para promover su crecimiento y multiplicación. Este procedimiento es fundamental en microbiología y persigue dos objetivos principales:

1. Aislamiento: Separar un microorganismo específico de una población mixta (heterogénea) para obtener un cultivo puro.
2. Repique o trasplante: Transferir un microorganismo ya aislado a un nuevo medio de cultivo para su conservación y propagación.

Técnica Aséptica: Prevención de la Contaminación

La transferencia de microorganismos de un ambiente a otro es una técnica esencial en el laboratorio de microbiología. Dado que el aire y las superficies están poblados por una gran diversidad de microorganismos, es crucial emplear la técnica aséptica para evitar la contaminación de los cultivos y medios de cultivo estériles.

Los contaminantes aéreos son la principal preocupación, ya que el aire contiene partículas de polvo que transportan comunidades microbianas. Por lo tanto, los recipientes deben manipularse de manera que se minimice la entrada de aire contaminado. Una vez aislado y propagado un microorganismo, es fundamental mantenerlo libre de contaminantes mediante técnicas de inoculación y subcultivo adecuadas.

El ansa de inoculación es la herramienta más común para transferir cultivos. En un tubo de ensayo con agar inclinado, el crecimiento microbiano se limita a la superficie del medio. Al extraer los microorganismos, se debe tocar únicamente el material superficial.

Condiciones de Cultivo de Microorganismos

El crecimiento microbiano depende de varios factores ambientales. A continuación, se describen las condiciones clave a considerar:

• Temperatura: Cada microorganismo tiene un rango de temperatura óptimo para su crecimiento. La temperatura de incubación se ajusta según el grupo fisiológico. Por ejemplo:
  • Bacterias (análisis de alimentos): 35-37°C.
  • Hongos y levaduras: 20-27°C.
• pH: Existe un rango de pH óptimo para cada microorganismo. Los medios para bacterias suelen tener un pH cercano a la neutralidad (pH 7), mientras que los medios para hongos y levaduras tienen un pH más ácido (pH 4-5.5).
• Presión osmótica: La composición del medio de cultivo debe tener en cuenta la presión osmótica adecuada para el microorganismo. Por ejemplo, los estafilococos toleran altas concentraciones de NaCl (7.5%).
• Requerimientos gaseosos: Los microorganismos se clasifican en aeróbicos, anaeróbicos o facultativos según sus necesidades de oxígeno. El medio de cultivo y las condiciones de incubación deben ajustarse a estos requerimientos.

Siembra en Medio Sólido: Preparación y Distribución

Los medios de cultivo sólidos, una vez esterilizados, se almacenan refrigerados. Para su uso, se deben fundir en baño María hasta que el agar esté completamente líquido. Luego, se deja enfriar a una temperatura adecuada (45-50°C) antes de distribuirlos en cajas de Petri o tubos estériles. Se deja solidificar a temperatura ambiente.

Si aparece agua de condensación en las cajas de Petri, se deben secar en estufa a 37°C en posición invertida hasta eliminar la humedad.

Procedimientos de Siembra y Aislamiento Microbiano

Parte 1: Diluciones Seriadas y Siembra en Placa

Esta técnica permite reducir la concentración de microorganismos en una muestra y obtener colonias aisladas en una placa de Petri.

1. Tomar una pipeta estéril y transferir 1 ml del cultivo mixto a un tubo con 9 ml de agua destilada estéril (ADE) (tubo 1).
2. Con otra pipeta estéril, aspirar y expeler la dilución del tubo 1 varias veces para homogeneizar.
3. Con la misma pipeta, transferir 1 ml al tubo 2 (que contiene 9 ml de ADE).
4. Descartar la pipeta y repetir la operación para cada uno de los tubos restantes con 9 ml de ADE.
5. Después de la última transferencia, tomar otra pipeta y, a partir de la última dilución, homogeneizar e inocular 0.1 ml en una caja de Petri con el medio de cultivo adecuado. Si es necesario, repetir la operación para la dilución anterior.
6. Diseminar la gota inoculada por la superficie del medio con una espátula de vidrio estéril (alcohol y llama). Mantener la caja semiabierta durante el proceso.
7. Importante: Esterilizar la espátula con alcohol y llama cada vez que se cambia de caja. Mantener el contenedor de alcohol alejado de la llama. Si se prende fuego, taparlo con una caja de Petri.
8. Etiquetar las cajas e incubarlas invertidas una vez secas.
9. Observar los resultados y tener en cuenta la dilución de partida al informar el recuento.

Parte 2: Método de Siembra en Estría o Agotamiento en Superficie

Esta técnica permite obtener colonias aisladas a partir de un cultivo mixto mediante la distribución de los microorganismos en la superficie del agar.

1. Introducir el ansa estéril en el caldo de cultivo mixto y extraer una pequeña cantidad de microorganismos.
2. Tomar la caja de Petri con medio sólido y dibujar con el ansa una serie de líneas estriadas sobre la superficie del agar, siguiendo un patrón específico (ver figura a continuación).
3. Abrir la caja de Petri solo lo necesario y mantener la tapa inclinada sobre el agar para protegerlo de la contaminación.
4. Evitar romper o perforar la superficie del agar durante la siembra.
5. El objetivo es depositar la mayoría de los microorganismos en las primeras estrías (sección 1) y continuar estriando sin cruzar las líneas. Las colonias mejor aisladas se obtendrán en las últimas estrías (sección 3 o 4).
6. Identificar la caja e incubar.
7. Observar el desarrollo de colonias.

Nota: Las cajas se incuban en posición invertida para evitar que la condensación gotee sobre la superficie de crecimiento y disperse los microorganismos.

*Esquema sugerido para la siembra por estrías:*

    
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Transferencia de un Cultivo Microbiano: Técnica Básica

Una colonia bacteriana del tamaño de una cabeza de alfiler puede contener millones de microorganismos. Por lo tanto, una pequeña cantidad de material adherido al ansa es suficiente para realizar una transferencia.

1. Colocar el mechero Bunsen y la muestra que contiene los microorganismos, así como el resto del material necesario (portaobjetos, tubos, placas), al alcance de la mano.
2. Flamear el ansa hasta que esté al rojo vivo y dejarla enfriar durante 10-15 segundos.
3. Con la otra mano, tomar el tubo que contiene los microorganismos y quitar el tapón. Sostener el tapón con el dedo meñique de la mano que sostiene el ansa. Nunca dejar el tapón sobre la mesa.
4. Flamear la boca del tubo para eliminar cualquier célula microbiana indeseable.
5. Introducir el ansa estéril en el tubo y extraer una pequeña cantidad de material microbiano.
6. Flamear nuevamente la boca del tubo y taparlo.
7. Tomar el nuevo tubo y flamear la boca como se hizo con el primero.
8. Introducir el ansa y depositar los microorganismos, ya sea en el medio líquido o mediante un suave roce sobre la superficie del agar.
9. Retirar el ansa, flamear la boca del tubo y taparlo.
10. Flamear el ansa para destruir los microorganismos adheridos.

Esta técnica básica, si se sigue correctamente, permite transferir cultivos bacterianos con un mínimo riesgo de contaminación.