Técnicas Inmunológicas

Inmunoprecipitación

Para la realización de estas técnicas se requiere que tanto el anticuerpo (Ac) como el antígeno (Ag) se encuentren en un medio fluido (sean solubles, no particulados) en el que sea posible la precipitación del complejo Ag-Ac.

Curva de calibración: La formación de una red óptima dependerá de la relación molecular entre Ag y Ac, y esto dependerá de la cantidad de epítopos del Ag, ya que los Ac son siempre bivalentes (2 valencias). El complejo Ag-Ac precipita espontáneamente o por centrifugación cuando la proporción de Ag y Ac en la mezcla es equivalente.

Nefelometría

Se basa en la dispersión de luz producida al incidir un haz de luz sobre una solución. Los cambios de dispersión ocurren por precipitación Ag-Ac. Se utilizan antisueros (Ac específicos) altamente purificados y ópticamente claros; la cantidad de antisuero es constante.

Inmunodifusión radial simple

Difusión de un Ag colocado en un pocillo en un gel de agarosa que lleva incorporado un Ac específico. Al difundir el Ag se genera un gradiente de concentración desde el pocillo donde se ha colocado. Cuando la concentración del Ag es la adecuada (zona de equivalencia) se forma un anillo de precipitación. Este anillo es fácilmente visible y las concentraciones antigénicas están en relación directa con el área del círculo de precipitación.

Inmunodifusión radial doble

Esta técnica se realiza en placas de agar en donde se practican pocillos. En uno de estos pozos se coloca el suero y en el resto el Ac preparado frente a la sustancia que se quiere identificar. Cuando difunden, en la zona de equivalencia se ve el precipitado. Técnica cualitativa.

Inmunoelectroforesis

Técnica cualitativa que permite la identificación de diferentes antígenos. La muestra se pone en un pocillo y se separa por electroforesis. En un pocillo central, se pone el anticuerpo. Por difusión, los Ag y el antisuero se encuentran, apareciendo el complejo Ag-Ac visible en forma de líneas de precipitación que pueden ser estudiadas por comparación con un sistema estándar.

Aglutinación

Cuando el Ag se encuentra unido o formando parte de células, bacterias o partículas inertes, la reacción Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular formado.

• Rápida o cualitativa: En un soporte sólido, consiste en mezclar Ag y Ac y observar la aglutinación. Resultado positivo o negativo.
• Lenta o cuantitativa: Se diluye el suero y se distribuye en tubos a los que se añade una concentración de Ag. Cuando hay equivalencia, se crea una red tridimensional. Se observa a qué concentración aglutina.
• Prueba de Coombs: Se realiza cuando los anticuerpos tienen poca capacidad aglutinante.
  • Directa: Se detectan anticuerpos unidos al eritrocito. Se añade el suero de Coombs; si aglutina, es positivo. Se utiliza en anemias hemolíticas autoinmunes, incompatibilidad de transfusiones y eritroblastosis fetal.
  • Indirecta: Se detectan anticuerpos sueltos en el suero. Primero se añaden eritrocitos sensibilizados (comercial), estos se unen al anticuerpo del suero. Se añade el suero de Coombs, que hace que aglutine si es positivo. Se utiliza en la determinación del Rh y grupos sanguíneos.

ELISA

Técnica semicuantitativa, automatizable.

• Directa: Detecta el antígeno de la muestra. En los pocillos está el anticuerpo, se añade la muestra con el antígeno y se unen. Se añade el Ac conjugado con una enzima, que se une al complejo Ag-Ac. Se añade un sustrato que va a reaccionar con la enzima produciendo color.
• Indirecta: Detecta anticuerpos en suero. El pocillo no lleva nada, se añade el antígeno comercial. Después se añade el suero que tiene anticuerpos, que se unen al antígeno. Se lava para eliminar el exceso. Posteriormente, se añade un antianticuerpo conjugado con enzima. Se añade el sustrato que, reaccionando con la enzima, produce color. Cuanto más color, más anticuerpos.

Radioinmunoensayo

El marcador es un radioisótopo que se cuantifica en un contador de centelleo.

• Directo: Detecta Ag en la muestra. Al soporte con Ac añadido, se le añade la muestra y el Ag marcado con radioisótopo. Los dos Ag compiten por unirse al Ac. Cuanto menos radiación, más Ag en la muestra, y cuanto más radiación, menos Ag en la muestra.
• Indirecto: Detecta anticuerpos en suero. El soporte no tiene nada. Se añade un Ag comercial que se adhiere al soporte. Luego se añaden los Ac del suero del paciente. Se añade Ac marcado con radioisótopo y se mide la radiación. La concentración de Ac es proporcional a la radiación.

Inmunofluorescencia

• Directa: Se cultiva la muestra en un cultivo celular, se incuba unos días, se pone en una porta con pocillos. Se añade un Ac conjugado con fluorocromo que se une al Ag. Por un microscopio de UV se mide la fluorescencia.
• Indirecta: El porta con células deshidratadas con Ag. Se añade el suero del paciente con Ac. Se hace un lavado para eliminar el exceso. Se añade el Ac conjugado con fluorocromo y se mira al microscopio.

Inmunoblotting

Para detectar Ac frente a mezclas complejas de Ag. En un gel se hace la electroforesis de todas las proteínas comerciales del VIH y se pasa a una tira de extracelulosa. Se añade el suero del paciente con Ac a la tira y después el antianticuerpo conjugado con enzima. Se añade el sustrato, que hace que se produzca color. Comparando las bandas obtenidas con el patrón, podremos saber si es VIH o no.

Inmunocromatografía

Utiliza Ac marcados con metales pesados. Se utilizan tiras. La muestra con Ag se añade y se difunde a través de la tira uniéndose al Ac conjugado con metal pesado y sigue difundiéndose. En la tira hay Ac específicos para el Ag de la muestra; se van a unir, viéndose una línea de color (positivo). Los que no se han unido al Ac, siguen adelante y se unen al anti-antiinmunoglobulina (control). Aparecen dos rayas. En el caso de que no se unan los Ag al Ac específico, el resultado es negativo, obteniendo una raya, en el control.