Termodinámica

El calor que se desprende o absorbe en una reacción a presión constante se denomina Entalpía (ΔH). Las reacciones en las que se desprende calor son exotérmicas y ΔH < 0. La función termodinámica que mide el desorden de un sistema recibe el nombre de entropía (ΔS). Ni la entropía ni la entalpía valen como criterio único para definir si una reacción es espontánea. Para ello utilizamos la energía libre de Gibbs: (ΔG).

ΔG = ΔH – TΔS

Espontáneamente se producen los procesos con ΔG < 0, por el contrario, no lo cursan los que su ΔG > 0. Una reacción cursará de izquierda a derecha si: ΔG > 0.

ΔG = ΔGº + RT ln [B]/[A]

Donde ΔGº es la energía estándar de la reacción.

Catabolismo y Anabolismo

Las reacciones catabólicas son aquellas que transforman estructuras complejas en simples y el anabolismo al revés. Podemos decir que las reacciones catabólicas: ΔG < 0 y las anabólicas: ΔG > 0. De esta forma, las reacciones anabólicas nunca tendrán espontaneidad en el organismo. Para que esto ocurra, las reacciones endergónicas (ΔG > 0) se acoplan a reacciones exergónicas (ΔG < 0) de manera que la energía desprendida en una de las reacciones es aprovechada por la otra. De esta manera, necesitamos una fuente de energía para realizar procesos anabólicos: el ATP. Que se obtiene de 2 formas:

• La fosforilación a nivel de sustrato (glucólisis).
• La fosforilación oxidativa (ciclo de Krebs, β-oxidación).

Base Molecular de la Genética

Ingeniería Genética

Enzimas de Restricción

Son aquellas que cortan el ADN, reconocen una frecuencia de ADN y cortan dicha parte. Tienen origen bacteriano y reconocen secuencias específicas de 4-8 nucleótidos. Una vez cortado, los extremos de ADN pueden ser romos o cohesivos. El tamaño medio de los fragmentos generados por el corte de una enzima con secuencia específica de 4 nucleótidos es de 256 bp. Cuando cortamos con el mismo enzima de restricción 2 ADN de origen biológicos distintos, generamos fragmentos compatibles, lo que da lugar a ADN recombinante.

Ejemplo:

Cuando se siembran bacterias, a la mañana siguiente se observa una pequeña “montañita” de bacterias perteneciente a una única molécula. Posteriormente, hacemos una réplica en placa para identificar las bacterias que queremos. Las bacterias que aparecen en la tetraciclina incorporan un plásmido con ADN humano. Si aparece en ambas placas, nos indica que ha incorporado ADN plasmático recircularizado.

Cálculo del nº de recombinantes:

N = ln (1 – P) / ln (1 – F)

Donde P = probabilidad y F = fracción del genoma en un solo recombinante.

Cuando se siembran bacterias, se observa una “montañita”. Se hace una réplica para saber qué bacterias debemos seleccionar, ya que habrá ADN humano o plásmido. Nos interesará la que aparezca ADN humano [es donde se encontrará la bacteria, la tetraciclina]. El conjunto de colonias se llama genoteca y no está ordenado porque procede de la digestión.

• Digestión parcial: fragmentos solapantes.
• Digestión total: solo hay un sitio de corte en el plásmido.

Las digestiones parciales permiten que no todos los sitios posibles susceptibles de corte por las enzimas de restricción sean cortados y forman fragmentos solapantes.

Mapeo de Restricción

Sirve para localizar un corte de ADN del genoma correspondiente con fines concretos. Por ejemplo, en virus y bacterias. Son de gran ayuda en el análisis estructural de genes y requieren el uso de 3 o más enzimas de restricción.

Recombinación de las Moléculas de ADN

Llamamos extremos cohesivos a la unión de extremos sobresalientes y extremos complementarios de cualquier ADN cortado con la misma enzima. 2 fragmentos de ADN de diferentes regiones genómicas forman el ADN recombinante. Los vectores con ADN circular, así como plásmidos.

Clonación

1. Se linealiza el ADN del plásmido con la misma enzima de restricción que se usa para fabricar el fragmento.
2. Se mezclan ambos ADN. Los extremos cohesivos hibridan con los extremos libres y cubren el “hueco” del ADN plásmido.
3. El resultado es un ADN circular aumentado.
4. Una ADN-Ligasa precinta la rotura de la hebra.
5. El plásmido recombinante se introduce en la E. coli donde puede multiplicarse. (el proceso se llama transformación)

Vectores Usados en Clonación Molecular

• Plásmido (bacteria, levadura). Característica: ADN circular. Tamaño: < 5-10 kb.
• Bacteriófago lambda (bacteria): Característica: ADN lineal viral. Tamaño inserto: alrededor de 20 kb.
• Cósmido (bacteria): Característica: Híbrido entre bacteriófago y fago. Tamaño inserto: alrededor de 50 kb.
• YAC (levadura): Característica: ADN con el centrómero telómero. Tamaño inserto: megabases.

Estructura de pBR322: Típico Vector de Clonación

• Procede de un plásmido natural.
• Tiene genes con resistencia a antibióticos.
• Tiene un sitio de restricción único para la inserción de ADN foráneo.
• Tiene un origen de replicación para su propagación en E. coli.

¿Cómo Podemos Aislar el Gen Responsable de una Enfermedad?

Hay 3 opciones posibles:

1. Comenzar con una proteína candidata: ADN <- proteína.
2. Comenzar con un ARN mensajero candidato: ADN <- ARNm.
3. Clonación posicional directa ADN.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza para ampliar secuencias de ADN. Las polimerasas que se utilizan provienen de bacterias de fuentes termales, ya que trabajan a alta temperatura sin desnaturalizarse. Para amplificar un ADN, seleccionamos la parte deseada, evitando los genes conservados, que son los mismos prácticamente entre especies. Esta técnica sirve para amplificar su fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad.

Funcionamiento:

• Inicio: en primer lugar, se lleva la reacción hasta una temperatura de 94-95ºC para activar la ADN polimerasa.
• Desnaturalización: se desnaturaliza el ADN (se separan las 2 cadenas de las cuales está constituido) a partir de la temperatura.
• Unión del cebador: a continuación, se produce la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su consecuencia complementaria en el ADN molde. Los primeros actuarán como límites de la molécula que va a ser simplificada.
• Elongación de la cadena: Actúa de ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como límite inicial, a temperatura de 72ºC.
• Elongación final: es una etapa única que se lleva a cabo a unos 70ºC tras el último ciclo de PCR, con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente amplificado.

Southern Blot

Es un método que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Se emplea una electroforesis en gel de agarosa para separar los fragmentos de ADN de acuerdo a su longitud y después una transferencia a una membrana en la cual se efectúa la hibridación de la sonda.

Northern Blot

Es igual que la Southern blot pero para ARN.

RT-PCR

Sirve para la copia del ARN, utilizamos una retrotranscriptasa que nos proporciona una cadena complementaria al cebador del ADN, así el ARN monocatenario es transformado en ADN complementario. Al salir del núcleo, los fragmentos de ARN necesitan una maduración. Los intrones son los fragmentos no válidos y los exones los válidos. Esto sirve para maximizar la información del ADN en un determinado espacio. Los cebadores tienen que estar en distintos exones ya que al extraer ARN siempre sacamos algo de ADN, los cebadores no diferencian entre el ADN residual y el ADN de la retrotranscriptasa. Al haber un intrón entre 2 exones, la amplitud varía y, por tanto, los cebadores diferencian entre ADN residual (corto) y ARN sin madurar (largo). En el caso de que no haya intrones, tenemos que utilizar DNasa para cortar y degradar el ADN residual.

Construcción de una Genoteca

Una genoteca es el conjunto de fragmentos de ADN de un organismo distribuido en un vector. Una vez construida, el siguiente paso es rastrearla (screening) a fin de seleccionar el clon o los clones que llevan el gen de interés.

Técnicas de Secuenciación

• Maxam-Gilbert (método químico): Se basa en la modificación química y posterior rotura del ADN. Permite utilizar un ADN purificado sin necesidad de clonarlo.
• Sanger (método enzimático): En este método se utilizan pocos reactivos tóxicos y cantidades menores de radiaciones que en el otro método.
• Secuenciación automática: Son variaciones del método de Sanger. Una de ellas es, por ejemplo, la secuenciación por terminador fluorescente.