Fundamento de la Tinción de Gram

Los principios de la tinción de Gram se basan en las características de la pared celular de las bacterias, la cual confiere propiedades determinantes en cada microorganismo. Las bacterias G+ poseen una pared celular gruesa compuesta de peptidoglicano (están compuestas por ácido teicoico que tiene como funciones dar factor de antigenicidad, controlar el tránsito de algunos cationes y aumentar la adherencia bacteriana epitelial), pero no cuentan con membrana celular externa. Retienen el cristal violeta después de la decoloración y aparecen de color violeta. Las bacterias G- tienen una pared celular constituida por una fina capa de peptidoglicano y una membrana celular externa, cuyo componente estructural único son los lipopolisacáridos. No son capaces de retener cristal violeta después de la decoloración y son teñidas con rojo de safranina.

Importancia Clínica de la Tinción

La tinción de Gram ha servido como criterio de clasificación bacteriana, ya que nos da las características fenotípicas de la bacteria en cuanto a tamaño, forma, agrupación y características tincionales. En algunos casos, permite la instauración de un tratamiento rápido y oportuno.

Técnica de Tinción de Gram

1) Se prepara el cultivo en un portaobjetos con un asa bacteriológica, colocando una pequeña cantidad de la colonia bacteriana.

2) Se deja secar y luego se fija la preparación pasando la placa por el mechero 2 o 3 veces.

3) Se agrega cristal violeta por 1 minuto (el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana, actuando como colorante primario) y se enjuaga.

4) Se agrega lugol por 1 minuto (sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta por la formación de un complejo cristal violeta-yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared) y se enjuaga.

5) Se agrega alcohol cetona y se enjuaga con agua inmediatamente (esta mezcla deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros, destruyendo la membrana externa de las G- ya que esta es soluble a la acción de solventes orgánicos como la mezcla de alcohol cetona).

6) Se agrega safranina por 30 segundos y se enjuaga seguidamente (la safranina funciona como un colorante secundario de contraste y sirve para teñir las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo).

Microscopio

Simple: lente biconvexa. Compuesto: maximiza los principios de agrandamiento y resolución en una observación específica.

Mecánico: base, brazo, platina, tornillo micro y macro, revólver, tubo.

Óptico: condensador (concentra rayos de luz), objetivos, ocular.

Sistema de iluminación: fuente de luz, espejos, condensador y diafragma.

Métodos Microscópicos

Microscopía de campo claro (óptica): la muestra se ve mediante transiluminación, la luz procedente del condensador atraviesa la muestra.

De campo oscuro: se usa un condensador que impide que la luz transmitida ilumine directamente la muestra, permite observar espiroquetas, treponemas.

De contraste de fases: permite examinar los detalles internos de los microorganismos.

Microscopía fluorescente: usa una lámpara de vapor de mercurio, de un halógeno o de xenón a presión elevada que emite una longitud de onda más corta.

Electrónica: genera una imagen tridimensional.

Poder de resolución: capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos.

Examen bacterioscópico: identifica microorganismos en muestras y así establecer un diagnóstico.

Morfología y Agrupación Bacteriana

Microorganismo: ser vivo o sistema biológico que solo puede visualizarse con el microscopio.

Células Eucariotas: (algas, hongos, protozoos), >5μm, membrana nuclear clásica, cadenas de ADN, reproducción sexual y asexual.

Células Procariotas (bacterias): 0.5-3μm, sin membrana nuclear, ADN único y circular, reproducción asexual.

Virus: 18-600 nm, contiene ADN o ARN pero no ambos, no es una célula, determina la enfermedad.

Forma y Agrupación de las Bacterias

Cocos

• Pares (diplococos): Neisseria meningitidis, N. gonorrhoeae, Moraxella.
• Cadenas (estreptococos): S. pneumoniae, S. pyogenes, S. viridans.
• Racimos (estafilococos): S. aureus, epidermidis, haemolyticus.
• Cubos (sarcina).

Bacilos

• Extremos redondeados: E. coli, Shigella, Proteus mirabilis.
• Fusiformes: Fusibacterium sp.
• En forma de palillo de tambor: C. tetani, C. botulinum.
• Agrupados en letras chinas: Corynebacterium diphtheriae.

Treponema: T. pallidum.

Borrelia: B. recurrentis.

Leptospira: Leptospira canicola.

Spirillum: S. minor.

Obtención, Manejo y Transporte de Muestras

1. Muestra del sitio real de infección con mínimo de contaminación en tejidos y órganos adyacentes.
2. Establecer el momento óptimo para la recuperación de microorganismos.
3. Obtener cantidad de muestra suficiente para la técnica solicitada.
4. Usar recipientes estériles.
5. Obtener cultivos antes de la administración de antibióticos.
6. Recipiente rotulado: nombre y apellido, número de identificación y fuente, diagnóstico presuntivo.
7. Encargado de la muestra debe usar barrera de protección: guantes, lentes, cubrebocas, bata.
8. Realizar asepsia adecuada.
9. Especificar diagnóstico probable.
10. Notar tipos de microorganismos que se sospechan como agentes causales.
11. Tomar muestras como potencialmente patógenas.
12. Tener conocimiento de esquemas de identificación que se usen en el laboratorio.

Toma de muestras: LCR, urocultivos, absceso, hemocultivo, coprocultivo, exudado faríngeo.

Mecanismos de Patogenicidad

: Para la bacteria el cuerpo humano, es un conjunto de nichos ambientales que le proporcional el calor, la humedad y el alimento necesarios para el crecimiento.
Puertas de entrada: Ingestion: Género salmonella, shigella, yersinia. Inhalación: Mycobacterium, mycoplasma pneumoniae, bordetella. Traumatismo: C. tetani, s. aureur. Venopunción: s, aureus, pseudomonas. Picadura de artrópodos: Ricketssia, coxiella, yersinia. Transmisión sex: Neisseria gonorrhoeae, chlamydia.

Parásito: org que vive sobre un 2º org denominado hospedador y k le causa daño. Parasitismo: tipo de relación entre 2 individuos de especies diferentes en la k uno de ellos se beneficia y otro sale perjudicado. Mutualismo: interacción biológica entre 2 invididuos de diferentes especies en donde ambos se benefician. Comensalismo: interaccón en la que uno se beneficia mientras que el otro no se perjudica ni se beneficia. Patogenicidad: capacidad del parásito pa causar daño al hospedero. Virulencia: grado de la capacidad de un microor para producir una enfermedad. Enfermedad: resultado del daño o la perdida de función de un tejido u organo debido a la infección o respuestas inflamatorias del hospedador. Infección: cualquier situación en la que un microor se está desarrollando y estableciendo en un hospedador, causando o no en el un daño.

Colonización, adhesión e invasión: Las bact pueden causar daño al huesped por: invasividad y toxicidad. Colonización: establecimiento del patógeno en los tej del huésped.  Adhesión: capacidad del patógeno para fijarse en una superficie con el fin de nutrirse y reproducirse. >Adhesinas: proteínas que se fijan a moléculas receptoras específicas sobre la cs hospedadora. Pilis: proyecciones citoplasmaticas parecidas a pelos. Biopelícula: son organizaciones microbianas compuestas x microorganismos que se adheren a la superficie, se unen y forman una capa. Invasión: proceso x el cual un microorg penetra el citoplasma de cs no fagocíticas, se replica, se propaga y finalmente lo destruye.

Mecanismos de virulencia: Adherencia: Proceso x el cual los microorg consiguen una posición más estable en el portal de entrada, lo que les permite no ser tan facil de eliminar. Se logra x medio de las moléculas de superficie adhesinas. Invasión: Hay bacterias invasivas que destruyen las barreras tisulares y tejidos susceptibles e inducen la inflamación. Metabolismo de crecimento: Cuando la bact necesita Fe, libera sideroforos al medio k se unen al hierro de las proteínas, cuando se froma el complejo Fe-sideróforo, x receptores de sideroforos, es incorporado a la bact. Toxinas: Componentes bacterianos que dañan directamente los tejidos o ponen en marcha actividades biológicas destructivas. Enzimas degradativas: Disgregan los tejidos, proporcionando asi alimento pal crecimiento de los microorg. Proteínas citotóxicas: Las bact G+ y – pueden fabricar proteínas (exotoxinas), entre las cuales estan las enzimas citolíticas y proteínas de unión a receptores que alteran la función o destruyen la cs.

Superantígeno: conforman un grupo especial de toxinas, que activan los linfocitos T para liberar grandes cantidades de interleucinas que ocasionan fiebre, shock, exantema. Evasón de la respuesta inmune y fagocítica: Cápsula: funcionan protegiendo a las bact de las respuestas inmunitarias y fagocíticas. Proliferación intracelular: muchas bact utilizan la cs como un lugar para proliferar y eludir las respuestas inmunitarias, así como un medio para diseminarse por todo el cuerpo.

Medios de cultivo: Selectivos: sirven para promover el desarrollo de un cierto tipo de bacterias inhibendo el resto, y los no selectivos sirven para el crecmiento de muchos microorg. Microorganismos anaerobios estrictos: no pueden crecer en presencia de o2. aerobios estrictos: requieren o2 para su metabolismo y crecimiento. Estudio bacteriológico: Determinación de presencia y características de bact en muestras biológicas como esputo, lágrimas, orina o heces. Agar: material gelatinoso, elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo.

Pruebas de eficacia antibacteriana: Esterilización: destrucción d todas las formas bacterianas incluyendo esporas. Desinfección: destrucción de la mayoría de formas microbianas, viables esporas. Desinfectante: Sustancia k elimina la viabilidad microbiana aplicados sobre objetos inanimados. Antisepsia: uso de productos quim sobre la piel o tejido vivo para inhibir o eliminar microorg. Asepsia: metodo para evitar k los gérmenes infecten algún lugar (ausencia de germenes que pueden causar una infección. Séptico: que contiene gérmenes patógenos. Germicida: producto capaz de destruir microorganismos.  Fungicida: k sirve para destruir los hongos parásitos. Viricida: sust k tiene la capacidad de destruir los virus. Eporicida: sustancia k destruye las esporas.

Antimicrobianos: sustancia capaz de actuar sobre los microorganismos inhibiendo su crecimiento o destruyéndolos. Quimioterápico: producto resultado de la síntesis química k es capaz de matar otros micoorg. Antibiótico: Producto de origen microbiano k es capaz de matar otros microorg dentro de un huesped.–> Bactericida: produce la muerte de las bacterias. Bacteriostático: no produce la muerte pero impide su reproducción. Espectro antibact: gama de actividad de un antimicrobiano frente a las bacterias. Antibiot de amplio espectro: actúan sobre una amplia gamma de bacterias g+ y g-. Espectro limitado: solo contra cocos G+ Y -. Espectro reducido: sector limitado de gérmenes (vancomicina)

Sinergismo: combinación de 2 antib k poseen mayor actividad bactericida cuando se emplean juntos. Antagonismo: comb de antibiot en la que la actividad de uno interfiere con la actividad del otro. Antibiosis: relación entre 2 especies donde una produce un material k mata o inhibe a la otra. Mecanismos de resistencia: Plásmidos: confieren alto nivel de resistencia a antibiot, codifican la producción bact, toxinas, determinantes de virulencia; Trasnposones: transfieren ADN de una posición a otra del genoma o entre distintas moléculas de ADN dentro de una misma cs; Integrones: poseen algunos plasm y transp elementos que les permiten capturar varios genes exogenos determinando la aparición de una resistencia a varios antibiot.

Trasnferencia de genes de resistencia entre bacterias: Conjugación: apareamiento o intercambio cuasisexual de información genética en una bacteria donante y otra receptora. Transformación: Es una captación activa y la incorporación de ADN exógeno. Transducción: transferencia de información genética de una bact a otra x medio de un bacteriofago.   Antibiograma: prueba que se realiza para determinar la susceptibilidad de una bact a un grupo de antibióticos.

Inhiben sintesis de pared celular  Penicilinas, cefalos, cefamicinas, carbapenems, monobactams Se une a las PBP y enzi responsables de la sint de peptidogDaptomicina despolar de la membrana citoPolimixina inhiben las memb bactbacitracina inhibe la mem cito bactIsoniazida, etionamida sint de ac. micólico

sintesis de proteínas

Aminoglucosidos Liber de cadenas peptidi aberrantes apartir del ribo 30sTetraciclinas prev la elongación polipept en el ribo 30sGlicilciclinas se unen al ribo 30s prev la inicia de la sint de prote Oxazolidinona prev. la inicia de la sint proteica en 50sMacrólidos, cetó, clindami, estreptograminas Prev elonga polipet en el ribo 50s

Resistencia bacteriana: mecanismo mediante el cual la bact puede disminuir la acción de los agentes antimicrobianos. Resistencia natu: carácter constante de cepas de una misma especia bact, es un mecanismo permanente, determinado geneticamente y sin correlación con la dosis de antibiot. Resistencia adqu: característica propia de una especie bact, k x naturaleza es sensible a un antibiotico pero k ha sido modificada geneticamente. Bacterias k desarrollan resistencia a los antibioticos: A cinetobacter baumanni (neumonía), pseudomonas acuriginosa, enterobacterias, enterococcus, H. pylory, salmonellae. Método de Kirby Bauer: sobre una placa de agar muller se inocula una cantidad de bact, sembrandolas de fomra uniforme, se colocan discos de papel filtro impregnados con concentraciones conocidas de los dif antibiot.

Resistencia bacteriana: mecanismo mediante el cual la bact puede disminuir la acción de los agentes antimicrobianos. Resistencia natu: carácter constante de cepas de una misma especia bact, es un mecanismo permanente, determinado geneticamente y sin correlación con la dosis de antibiot. Resistencia adqu: característica propia de una especie bact, k x naturaleza es sensible a un antibiotico pero k ha sido modificada geneticamente. Bacterias k desarrollan resistencia a los antibioticos: A cinetobacter baumanni (neumonía), pseudomonas acuriginosa, enterobacterias, enterococcus, H. pylory, salmonellae. Método de Kirby Bauer: sobre una placa de agar muller se inocula una cantidad de bact, sembrandolas de fomra uniforme, se colocan discos de papel filtro impregnados con concentraciones conocidas de los dif antibiot.

Dx de infecciones causadas x staphylococcus: Características: cocos g+ se desarrollan en racimos. 0.5-1.5μ.
Capsula y capa de limo: Evade la fagocitosis. Peptidoglucano y enzimas: producción de pirogeno endogeno y las enzimas catalizan la construcción de la capa de peptidog. Ac. teicoicos y lipoteicoicos: estimulo debil de la reacción humoral. Proteínas de adhesión a la superficie: son factores de virulencia, son unidas de modo covalente al peptidog de la pared cel en staphulo y han sido designadas como proteínas. Membrana cito: actúa de barrera osmótca para la cs y proporciona una sujección pa la biosintesis cel

Patogenia e inmunidad: la patología depende de la capcacidad de las bact para evadir la fagocitosis, producir proteínas de superficie que median la adherencia a los tejidos del hospedador durante la colonización. Regulación de los genes de virulencia: Sistema de control x quorum sensing permite la expresión de proteínas de adhesion. Defensas contra la inmunidad innata: los staphylos encapsulados se unen a las opsoninas y la capsula sobre estas portege a las bacterias de inhibir la fagocitosis. Toxinas estafilocócicas: s.aureus produce un gran #de toxinas citolíticas k dañan la membrana (α,β,δ,γ)

Citotoxinas: β: cataliza la hidroliss de los fosfolipidos de la membrana. δ: actua como surfactante k altera las memb cel. γ: la lisis cel provocada x las toxinas gamm es mediada x la formación de poros con aumento de permeabilidad a cationes.

Factores de virulencia staphylo aureus:
Componentes estructurales:
capsula-> inhibe la quimiotaxis
capa de limo -> facilita la adherencia
peptidoglucanos-> aporta estabilidad osmótica
proteina A-> inhibe la eliminación mediada x anticuerpos

Toxinas:  Citotoxinas: toxicas pa leucos, eritros, fibroblas, macrof. Toxinas exfoliativas (ETA, ETB)-> proteasas de serinas k rompen los puentes intracel del estrato granuloso de la epidemis Toxina 1 del sx del shock tóxico-> superantígeno, condiciona la fuga o destrucción cel de las cs endot
Enzimas: Coagulasa-> convierte el fibrinogeno en fibrina. Hialuronidasa-> hidroliza los ac. hialurónicos del tej conj, induciendo la diseminación de los estafis x el tejido. Fibrinolisna-> disuelve los cogaulos de fibrina Lipasas-> hidrolizan los lípidos. Nucelasas -> hidrolizan el ADN –Dif entre enzimas y toxinas: tox-> son sust producidas x una bact, planta o animal k son venenosas o tóxicas para el ser humano. Enzimas-> son proteínas k catalizan las reacciones químicas de los org vivos.

Enfermedades producidas por staphylos: Supurativas: impétigo, foliculitis, forunculos, antrax, bacteremia y endocarditis, neumonía y epiema, artritis séptica.
No supurativas: Sx de piel escaldada (enfemedad de Ritter), descamcación diseminada del epit lactante, ampollas caerentes de leucocitos o microorg, intoxicación alimentaria, shock tóxico.
Sitios del cuerpo donde se encuentra como flora normal: s. aureus-> pel, conjuntiva, nariz, faringe, boca, uretra, vagina. S. epidermidis-> piel, nariz, faringe, boca, uretra, vagina.
Epidemiología: flora normal en la piel humana y en las superficies mucosas, pueden sobvrevivir en superficies secas, transmisión de persona a persona mediante contacto directo.


Pruebas de lab staphylos: medios selectivos (agar manitol-sal), pruebas de identificación de ac nucelicos, s.aureus puede identificarse mediante pruebas bioquímicas (coagulasa). Tratamiento: las infecciones localizadas se tratan mediante insición y drenaje, el tx emprírico debe constar de antibióticos activos contras las cepas SARM, la terapia oral puede constar de trimetoprima, sulfametoxazol.

Autoclave: E.coli-> E; bacillus subtilis -> E; Staphylos aureus-> E –> Desnaturalización de prot
Ebullición 3′: E; NE; E–> desnaturalización de prot  Ebullición 20′: E; E; NE-> «»
Iodopovidona: E, NE, NE–>Oxidación de prot   Yodopolivnil pirrolidona: NE; NE; NE-> Ox de prot
Ac. hipocloroso: NE; NE; NE–>Ox irreversible de grupos sulfhidrilo de enzimas esenciales.
Etanol 70%: NE; NE; NE–> Destruye la memb cel y desnatu de prot Benzal: E; E; E–> lesionan la memb celular   Krit: E; E; E;–> » »   Antisapril: NE; NE; NE–> = que el cloro
Alkacide: E; NE; E–>alquilación de grupos quím de las proteínas, pared cel actua a nivel de los puentes cruzados de peptidog Peroxido de H: E; E; E–> efectos oxidantes los cuales atacan a los lípidos, prot y ADN