Tipos y Características de Sondas para Hibridación Molecular

Resumen: Sondas y Marcaje

(Puntos 4.3 y 4.4 del libro)

4.3. Tipos y Características de las Sondas

Sonda: Cadena de nucleótidos cuya secuencia de bases nitrogenadas es complementaria a la secuencia diana.

Las sondas pueden ser:

Sondas de ADN

De síntesis química
De ADN recombinante
PCR

Sondas de ARN

De síntesis química
De transcripción

Sondas Químicas Sintéticas de Ácidos Nucleicos

Sondas de ácidos nucleicos peptídicos (PNA)
Sondas de ácidos nucleicos bloqueados (LNA)

4.3.1. Características Generales de las Sondas

Pueden ser monocatenarias o bicatenarias. Tamaño variable (pequeñas o grandes).

La elección de un tipo de sonda u otra depende de:

Características de la sonda:
- Especificidad: Capacidad para distinguir la secuencia diana. Tamaño mínimo de 16 bases. A menores tamaños, hibridación inespecífica.
- Sensibilidad: Probabilidad de detectar cantidades mínimas del híbrido sonda-diana. Depende del número de moléculas marcadoras que admita la sonda.
Tipo de muestra.
Tipo de técnica de hibridación a utilizar.

4.3.2. Sondas de ADN

Características:

Son las más utilizadas.
Fáciles de obtener y muy variadas.
Cinética de desnaturalización y renaturalización muy estudiada.
Se clasifican según el proceso de obtención en: de síntesis química, de ADN recombinante y de PCR.

SONDA DE ADN	SÍNTESIS QUÍMICA	ADN RECOMBINANTE	PCR
OBTENCIÓN	Condensación química secuencial de los desoxinucleótidos (Automatizado)	Proceso de clonación y amplificación en cultivo.	Amplificación de la sonda por PCR.
CADENA	Monocatenarias	Bicatenarias	Bicatenarias
TAMAÑO	Reducido: 40-50 nucleótidos (lo más frecuente)	Grande: cientos/miles de pb	Intermedio: cientos de pb.
CARACTERÍSTICAS		Obtención a partir de plásmidos bacterianos.
VENTAJAS	No requieren desnaturalización. Fácil penetración en tejidos (in situ).	Gran sensibilidad por admitir muchos marcadores. Específicas.
INCONVENIENTES	Baja sensibilidad. Hibridación inespecífica, hacer en condiciones estrictas.	Hay que desnaturalizar previo a la hibridación.	Hay que conocer las secuencias que flanquean el fragmento a amplificar.

4.3.3. Sondas de ARN o Ribosondas

Características:

Son siempre monocatenarias.
Los híbridos ADN/ARN son más estables que los ADN/ADN.
Son muy sensibles a la contaminación por ARNasas.

SONDA ARN	SÍNTESIS QUÍMICA	TRANSCRIPCIÓN
OBTENCIÓN	Condensación química secuencial de ribonucleótidos	Transcripción de un vector que contiene el fragmento de interés a ADNc mediante ARN polimerasa.
CADENA	Monocatenaria	Monocatenaria
TAMAÑO		Intermedio (cientos de bases)
VENTAJAS	No requieren desnaturalización. Fácil penetración en tejidos (in situ).
INCONVENIENTES	Baja sensibilidad. Hibridación inespecífica, hacer en condiciones estrictas.

4.3.4. Sondas Químicas Sintéticas de Ácidos Nucleicos

Se están comenzando a comercializar modificaciones químicas sintéticas de los ácidos nucleicos.

SONDA SINTÉTICA	ÁCIDOS NUCLEICOS PEPTÍDICOS (PNA)	ÁCIDOS NUCLEICOS BLOQUEADOS (LNA)
OBTENCIÓN	Oligómero sintético en el que el esqueleto azúcar-fosfato es sustituido por un esqueleto de aminoetilglicina.	Síntesis química de oligómeros sintéticos de ribonucleótidos, en los que se modifican químicamente algunas de las ribosas.
TAMAÑO	≤ 30 bases	Pequeño tamaño
CARACTERÍSTICAS	No tienen carga eléctrica. No son degradadas por nucleasas. Gran estabilidad. Hibridación por puentes de hidrógeno.	Muy usadas en hibridación in situ.
VENTAJAS	Hibridan más rápidamente que las de ADN y/o ARN. Híbridos resultantes más estables. La fuerza iónica del medio influye poco en los híbridos. Muy específicas: capacidad para discriminar bases no complementarias.	Mayor sensibilidad y especificidad que las de ARN
INCONVENIENTES	Solubilidad menor que las de ADN y ARN. Solo por síntesis química.

4.4. El Marcaje de las Sondas

Marcaje: Procedimiento de marcar la sonda utilizada en las técnicas de hibridación con la finalidad de poder visualizar los resultados.

4.4.1. Tipos de Marcadores

El tipo de marcador utilizado condicionará el método de detección del híbrido.

Marcadores que posibilitan la detección directa del híbrido:
- Isótopos radioactivos: Elementos químicos con capacidad de emitir radiaciones. La sonda se marca introduciendo nucleótidos con dichos isótopos. Se detectan mediante autorradiografía (película de rayos X). Se usan en técnicas de hibridación en filtro: Southern blot, Northern blot, dot blot.
- Fluorocromos: Compuestos químicos que emiten luz al ser excitados por luz UV. Los marcadores fluorescentes se acoplan a los nucleótidos. Para la detección del híbrido es necesario un microscopio de fluorescencia. Se usan en técnicas de hibridación in situ fluorescente.

Marcadores que requieren métodos indirectos de revelado:
- Haptenos (digoxigenina y biotina): Moléculas de pequeño tamaño que, al igual que los fluorocromos, se pueden acoplar a los nucleótidos y no alteran la especificidad de la sonda, pero no pueden ser detectados directamente. La detección del híbrido requiere métodos indirectos basados en:
  - Afinidad química de moléculas.
  - Métodos inmunológicos.

Se pueden usar en prácticamente todas las técnicas de hibridación. Son menos sensibles, pero se pueden emplear métodos que amplifican la señal, aumentando la sensibilidad.

4.4.2. Métodos de Marcaje

La mayoría usan reacciones enzimáticas y se basan en la incorporación a la sonda de nucleótidos marcados.

MÉTODO	UTILIDAD	FUNDAMENTO	REACTIVOS
Desplazamiento de Mella	Marcar sondas de ADN bicatenario obtenidas por ADN recombinante.	La ADNasa I produce mellas (rotura de enlaces fosfodiéster) al azar. La ADN polimerasa I intenta reparar las mellas y lo hace eliminando nucleótidos y añadiendo desoxirribonucleótidos, entre ellos el marcado.	ADNasa I ADN Polimerasa I bacteriana. Mezcla de 4 desoxirribonucleótidos marcados con isótopos radiactivos o haptenos.
Cebado al Azar	Para marcar sondas de ADN bicatenario con isótopos radiactivos o haptenos	Desnaturalizar la sonda. Unión de los hexámeros a las cadenas de la sonda al azar. Los hexámeros actúan como cebadores para que la ADN polimerasa I sintetice cadenas de ADN complementarias a la cadena que actúa de molde, incorporando desoxirribonucleótidos, uno de ellos marcado.	Mezcla de todos los oligonucleótidos posibles de 6 bases. Fragmento Klenow de la ADN polimerasa I (solo actividad polimerasa) Mezcla de desoxirribonucleótidos trifosfato, uno de ellos marcado.
Marcaje Terminal Único Extremo 3′	Para marcar sondas de ADN bicatenario o monocatenario, de pequeño y mediano tamaño. Radiactivamente, con fluorocromos o haptenos.	Un único nucleótido marcado en el extremo 3′.	Didesoxinucleótido marcado.
Marcaje Terminal Cola Nucleótidos Marcados	Para marcar sondas de ADN bicatenario o monocatenario, de pequeño y mediano tamaño. Radiactivamente, con fluorocromos o haptenos.	Cola de nucleótidos marcados de longitud variable.	Cola de nucleótidos marcados.
PCR		Se realiza en el mismo proceso de obtención de la sonda por PCR	Desoxinucleótidos marcados radiactivamente o con haptenos.
Sondas ARN		El marcaje se hace en el mismo procedimiento de la obtención de la sonda ARN mediante transcripción con una ARN polimerasa.	Ribonucleótidos marcados